Heterogeneïtat de les fibres musculars esquelètiques humanes més enllà de la cadena pesada de miosina

Gràcies per visitar nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu la darrera versió del navegador (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir un suport continu, aquest lloc web estarà lliure d'estils i JavaScript.
El múscul esquelètic és un teixit heterogeni compost predominantment per miofibril·les, que en humans es classifiquen normalment en tres tipus: una de "lenta" (tipus 1) i dues de "ràpides" (tipus 2A i 2X). Tanmateix, l'heterogeneïtat entre i dins dels tipus tradicionals de miofibril·les continua sent poc coneguda. Vam aplicar enfocaments transcriptòmics i proteòmics a 1050 i 1038 miofibril·les individuals del vast lateral humà, respectivament. L'estudi proteòmic va incloure homes, i l'estudi transcriptòmic va incloure 10 homes i 2 dones. A més de les isoformes de la cadena pesada de miosina, vam identificar proteïnes metabòliques, proteïnes ribosòmiques i proteïnes d'unió cel·lular com a fonts de variabilitat intermiofibril·lar multidimensional. A més, malgrat la identificació de grups de fibres lentes i ràpides, les nostres dades suggereixen que les fibres de tipus 2X són fenotípicament indistinguibles d'altres fibres de contracció ràpida. A més, la classificació basada en la cadena pesada de miosina és insuficient per descriure el fenotip de les miofibres en les miopaties nemalines. En general, les nostres dades suggereixen una heterogeneïtat multidimensional de les miofibres, amb fonts de variació que s'estenen més enllà de les isoformes de la cadena pesada de la miosina.
L'heterogeneïtat cel·lular és una característica inherent a tots els sistemes biològics, que permet a les cèl·lules especialitzar-se per satisfer les diferents necessitats dels teixits i les cèl·lules.1 La visió tradicional de l'heterogeneïtat de la fibra muscular esquelètica ha estat que les neurones motores defineixen el tipus de fibra dins d'una unitat motora, i que el tipus de fibra (és a dir, tipus 1, tipus 2A i tipus 2X en humans) està determinat per les característiques de les isoformes de la cadena pesada de miosina (MYH).2 Això es va basar inicialment en la seva inestabilitat de l'ATPasa del pH,3,4 i més tard en la seva expressió molecular de MYH.5 Tanmateix, amb la identificació i posterior acceptació de fibres "mixtes" que coexpressen múltiples MYH en proporcions variables, les fibres musculars esquelètiques es veuen cada cop més com un continu en lloc de com a tipus de fibra diferents.6 Malgrat això, el camp encara depèn en gran mesura de MYH com a classificador principal per a la classificació de les miofibres, una visió probablement influenciada per les limitacions i els biaixos significatius dels primers estudis en rosegadors, els perfils d'expressió de MYH i la gamma de tipus de fibres dels quals difereixen dels dels humans.2 La situació es complica encara més pel fet que els diferents músculs esquelètics humans presenten una gamma diversa de tipus de fibres.7 El El vast lateral és un múscul mixt amb un perfil d'expressió de MYH intermedi (i per tant representatiu).7 A més, la seva facilitat de mostreig el converteix en el múscul més ben estudiat en humans.
Per tant, la investigació imparcial de la diversitat de les fibres musculars esquelètiques mitjançant potents eines "òmiques" és crítica però també desafiant, en part a causa de la naturalesa multinucleada de les fibres musculars esquelètiques. Tanmateix, les tecnologies de transcriptòmica8,9 i proteòmica10 han experimentat una revolució en la sensibilitat en els darrers anys a causa de diversos avenços tecnològics, permetent l'anàlisi del múscul esquelètic amb resolució de fibra única. Com a resultat, s'han fet progressos significatius en la caracterització de la diversitat de fibra única i la seva resposta a estímuls atròfics i a l'envelliment11,12,13,14,15,16,17,18. És important destacar que aquests avenços tecnològics tenen aplicacions clíniques, permetent una caracterització més detallada i precisa de la desregulació associada a malalties. Per exemple, la fisiopatologia de la miopatia nemalínica, una de les malalties musculars hereditàries més comunes (MIM 605355 i MIM 161800), és complexa i confusa.19,20 Per tant, una millor caracterització de la desregulació de les fibres musculars esquelètiques podria conduir a avenços significatius en la nostra comprensió d'aquesta malaltia.
Vam desenvolupar mètodes per a l'anàlisi transcriptòmica i proteòmica de fibres musculars esquelètiques individuals aïllades manualment de mostres de biòpsia humana i els vam aplicar a milers de fibres, cosa que ens va permetre investigar l'heterogeneïtat cel·lular de les fibres musculars esquelètiques humanes. Durant el transcurs d'aquest treball, vam demostrar el poder de la fenotipificació transcriptòmica i proteòmica de les fibres musculars i vam identificar proteïnes metabòliques, ribosòmiques i d'unió cel·lular com a fonts significatives de variabilitat interfibres. A més, utilitzant aquest flux de treball proteòmic, vam caracteritzar la rellevància clínica de la miopatia per nematodes en fibres musculars esquelètiques individuals, revelant un desplaçament coordinat cap a fibres no oxidatives independents del tipus de fibra basat en la miopatia per nematodes.
Per investigar l'heterogeneïtat de les fibres musculars esquelètiques humanes, vam desenvolupar dos fluxos de treball per permetre l'anàlisi del transcriptoma i el proteoma de fibres musculars esquelètiques individuals (Figura 1A i Figura Suplementària 1A). Vam desenvolupar i optimitzar diversos passos metodològics, des de l'emmagatzematge de mostres i la preservació de la integritat de l'ARN i les proteïnes fins a l'optimització del rendiment per a cada enfocament. Per a l'anàlisi del transcriptoma, això es va aconseguir inserint codis de barres moleculars específics de la mostra al pas inicial de la transcripció inversa, permetent agrupar 96 fibres per a un processament posterior eficient. Una seqüenciació més profunda (±1 milió de lectures per fibra) en comparació amb els enfocaments tradicionals d'una sola cèl·lula va enriquir encara més les dades del transcriptoma. 21 Per a la proteòmica, vam utilitzar un gradient cromatogràfic curt (21 minuts) combinat amb l'adquisició de dades DIA-PASEF en un espectròmetre de masses timsTOF per optimitzar la profunditat del proteoma mantenint un alt rendiment. 22,23 Per investigar l'heterogeneïtat de les fibres musculars esquelètiques sanes, vam caracteritzar els transcriptomes de 1.050 fibres individuals de 14 donants adults sans i els proteomes de 1.038 fibres de 5 donants adults sans (Taula suplementària 1). En aquest article, aquests conjunts de dades es denominen transcriptomes i proteomes de 1.000 fibres, respectivament. El nostre enfocament va detectar un total de 27.237 transcrits i 2.983 proteïnes en les anàlisis transcriptòmiques i proteòmiques de 1.000 fibres (Figura 1A, Conjunts de dades suplementaris 1-2). Després de filtrar els conjunts de dades transcriptòmiques i proteòmiques per a >1.000 gens detectats i un 50% de valors vàlids per fibra, es van realitzar anàlisis bioinformàtiques posteriors per a 925 i 974 fibres del transcriptoma i el proteoma, respectivament. Després del filtratge, es va detectar una mitjana de 4257 ± 1557 gens i 2015 ± 234 proteïnes (mitjana ± SD) per fibra, amb una variabilitat interindividual limitada (Figures suplementàries 1B-C, Conjunts de dades suplementaris 3-4). Tanmateix, la variabilitat dins del subjecte va ser més pronunciada entre els participants, probablement a causa de les diferències en el rendiment d'ARN/proteïna entre fibres de diferents longituds i àrees de secció transversal. Per a la majoria de proteïnes (>2000), el coeficient de variació va ser inferior al 20% (Figura suplementària 1D). Ambdós mètodes van permetre capturar una àmplia gamma dinàmica de transcrits i proteïnes amb signatures altament expressades importants per a la contracció muscular (per exemple, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figures suplementàries 1E-F). La majoria de les característiques identificades eren comunes entre els conjunts de dades transcriptòmiques i proteòmiques (Figura suplementària 1G), i les intensitats mitjanes UMI/LFQ d'aquestes característiques estaven raonablement ben correlacionades (r = 0,52) (Figura suplementària 1H).
Flux de treball de transcriptòmica i proteòmica (creat amb BioRender.com). Corbes de rang dinàmic BD per a MYH7, MYH2 i MYH1, i llindars calculats per a l'assignació del tipus de fibra. E, F Distribució de l'expressió MYH entre fibres en conjunts de dades de transcriptòmica i proteòmica. G, H Gràfics d'Aproximació i Projecció de Diversitat Uniforme (UMAP) per a transcriptòmica i proteòmica acolorits per tipus de fibra basat en MYH. I, J Gràfics de característiques que mostren l'expressió MYH7, MYH2 i MYH1 en conjunts de dades de transcriptòmica i proteòmica.
Inicialment ens vam proposar assignar un tipus de fibra basat en MYH a cada fibra mitjançant un enfocament optimitzat que aprofita l'alta sensibilitat i el rang dinàmic de l'expressió de MYH en conjunts de dades òmiques. Estudis anteriors han utilitzat llindars arbitraris per etiquetar fibres com a tipus 1 pur, tipus 2A, tipus 2X o mixtes basant-se en un percentatge fix d'expressió de diferents MYH11,14,24. Vam utilitzar un enfocament diferent en què l'expressió de cada fibra es va classificar segons els MYH que vam utilitzar per tipificar les fibres: MYH7, MYH2 i MYH1, corresponents a fibres de tipus 1, tipus 2A i tipus 2X, respectivament. A continuació, vam calcular matemàticament el punt d'inflexió inferior de cada corba resultant i el vam utilitzar com a llindar per assignar fibres com a positives (per sobre del llindar) o negatives (per sota del llindar) per a cada MYH (Figura 1B-D). Aquestes dades demostren que MYH7 (Figura 1B) i MYH2 (Figura 1C) tenen perfils d'expressió activats/desactivats més diferents a nivell d'ARN en comparació amb el nivell de proteïna. De fet, a nivell de proteïna, molt poques fibres no expressaven MYH7, i cap fibra tenia una expressió de MYH2 del 100%. A continuació, vam utilitzar llindars d'expressió predeterminats per assignar tipus de fibres basades en MYH a totes les fibres de cada conjunt de dades. Per exemple, les fibres MYH7+/MYH2-/MYH1- es van assignar al tipus 1, mentre que les fibres MYH7-/MYH2+/MYH1+ es van assignar al tipus mixt 2A/2X (vegeu la Taula suplementària 2 per a una descripció completa). En agrupar totes les fibres, vam observar una distribució notablement similar dels tipus de fibres basades en MYH tant a nivell d'ARN (Figura 1E) com de proteïna (Figura 1F), mentre que la composició relativa dels tipus de fibres basades en MYH variava entre els individus, tal com s'esperava (Figura suplementària 2A). La majoria de les fibres es van classificar com a tipus 1 pur (34-35%) o tipus 2A (36-38%), tot i que també es va detectar un nombre significatiu de fibres mixtes de tipus 2A/2X (16-19%). Una diferència sorprenent és que les fibres pures de tipus 2X només es podien detectar a nivell d'ARN, però no a nivell de proteïna, cosa que suggereix que l'expressió ràpida de MYH està regulada almenys parcialment posttranscripcionalment.
Vam validar el nostre mètode de tipificació de fibres MYH basat en proteòmica mitjançant dot blotting basat en anticossos, i ambdós mètodes van aconseguir una concordança del 100% en la identificació de fibres pures de tipus 1 i tipus 2A (vegeu la Figura suplementària 2B). Tanmateix, l'enfocament basat en proteòmica va ser més sensible i més eficient a l'hora d'identificar fibres mixtes i quantificar la proporció de cada gen MYH a cada fibra. Aquestes dades demostren l'eficàcia d'utilitzar un enfocament objectiu i altament sensible basat en òmica per caracteritzar els tipus de fibres musculars esquelètiques.
A continuació, vam utilitzar la informació combinada proporcionada per la transcriptòmica i la proteòmica per classificar objectivament les miofibres basant-nos en el seu transcriptoma o proteoma complet. Utilitzant el mètode d'aproximació i projecció de varietat uniforme (UMAP) per reduir la dimensionalitat a sis components principals (Figures suplementàries 3A-B), vam poder visualitzar la variabilitat de les miofibres al transcriptoma (Figura 1G) i al proteoma (Figura 1H). Cal destacar que les miofibres no es van agrupar per participants (Figures suplementàries 3C-D) ni per dies de prova (Figura suplementària 3E) ni en els conjunts de dades de transcriptòmica ni en els de proteòmica, cosa que suggereix que la variabilitat dins del subjecte en les fibres musculars esquelètiques és més alta que la variabilitat entre subjectes. Al gràfic UMAP, van sorgir dos clústers diferents que representen les miofibres "ràpides" i "lentes" (Figures 1G-H). Les miofibres MYH7+ (lentes) es van agrupar al pol positiu d'UMAP1, mentre que les miofibres MYH2+ i MYH1+ (ràpides) es van agrupar al pol negatiu d'UMAP1 (Figures 1I-J). Tanmateix, no es va fer cap distinció entre els tipus de fibres de contracció ràpida (és a dir, tipus 2A, tipus 2X o mixtes 2A/2X) en funció de l'expressió de MYH, cosa que suggereix que l'expressió de MYH1 (Figura 1I-J) o altres marcadors clàssics de miofibres 2X com ara ACTN3 o MYLK2 (Figures suplementàries 4A-B) no diferencia entre els diferents tipus de miofibres quan es considera tot el transcriptoma o proteoma. A més, en comparació amb MYH2 i MYH7, pocs transcrits o proteïnes es van correlacionar positivament amb MYH1 (Figures suplementàries 4C-H), cosa que suggereix que l'abundància de MYH1 no reflecteix completament el transcriptoma/proteoma de les miofibres. Es van arribar a conclusions similars en avaluar l'expressió mixta de les tres isoformes MYH a nivell UMAP (Figs suplementàries 4I-J). Així, mentre que les fibres 2X es poden identificar a nivell de transcrit basant-se només en la quantificació de MYH, les fibres MYH1+ no es distingeixen d'altres fibres ràpides quan es considera tot el transcriptoma o proteoma.
Com a exploració inicial de l'heterogeneïtat de les fibres lentes més enllà de MYH, vam avaluar quatre proteïnes específiques de tipus de fibra lenta establertes: TPM3, TNNT1, MYL3 i ATP2A22. Els subtipus de fibres lentes van mostrar correlacions de Pearson altes, tot i que no perfectes, amb MYH7 tant en transcriptòmica (Figura suplementària 5A) com en proteòmica (Figura suplementària 5B). Aproximadament el 25% i el 33% de les fibres lentes no es van classificar com a fibres lentes pures per tots els subtipus de gens/proteïnes en transcriptòmica (Figura suplementària 5C) i proteòmica (Figura suplementària 5D), respectivament. Per tant, la classificació de les fibres lentes basada en múltiples subtipus de gens/proteïnes introdueix una complexitat addicional, fins i tot per a proteïnes que se sap que són específiques del tipus de fibra. Això suggereix que la classificació de les fibres basada en isoformes d'una sola família de gens/proteïnes pot no reflectir adequadament la veritable heterogeneïtat de les fibres musculars esquelètiques.
Per explorar més a fons la variabilitat fenotípica de les fibres musculars esquelètiques humanes a l'escala de tot el model òmic, vam realitzar una reducció de la dimensionalitat imparcial de les dades mitjançant l'anàlisi de components principals (PCA) (Figura 2A). De manera similar als gràfics UMAP, ni el participant ni el dia de la prova van influir en l'agrupació de fibres a nivell de PCA (Figures suplementàries 6A-C). En ambdós conjunts de dades, el tipus de fibra basat en MYH es va explicar mitjançant PC2, que va mostrar un grup de fibres de contracció lenta de tipus 1 i un segon grup que contenia fibres de contracció ràpida de tipus 2A, tipus 2X i fibres mixtes 2A/2X (Figura 2A). En ambdós conjunts de dades, aquests dos grups estaven connectats per un petit nombre de fibres mixtes de tipus 1/2A. Com s'esperava, l'anàlisi de sobrerepresentació dels principals impulsors de PC va confirmar que PC2 estava impulsat per signatures contràctils i metabòliques (Figura 2B i Figures suplementàries 6D-E, Conjunts de dades suplementaris 5-6). En general, es va trobar que el tipus de fibra basat en MYH era suficient per explicar la variació contínua al llarg de PC2, amb l'excepció de les anomenades fibres 2X que es distribuïen per tot el transcriptoma dins del clúster ràpid.
A. Gràfics d'anàlisi de components principals (PCA) de conjunts de dades del transcriptoma i el proteoma acolorits segons el tipus de fibra basats en MYH. B. Anàlisi d'enriquiment dels impulsors de transcrits i proteïnes en PC2 i PC1. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant el paquet clusterProfiler i els valors p ajustats per Benjamini-Hochberg. C, D. Gràfics PCA acolorits segons els termes de l'ontologia gènica de l'adhesió intercel·lular (GO) al transcriptoma i els termes GO dels costàmers al proteoma. Les fletxes representen els impulsors de transcrits i proteïnes i les seves direccions. E, F. Gràfics de característiques d'aproximació i projecció de varietats uniformes (UMAP) de característiques clínicament rellevants que mostren gradients d'expressió independents del tipus de fibra lenta/ràpida. G, H. Correlacions entre els impulsors de PC2 i PC1 en transcriptomes i proteomes.
Inesperadament, el tipus de miofibra basat en MYH només va explicar el segon grau més alt de variabilitat (PC2), cosa que suggereix que altres factors biològics no relacionats amb el tipus de miofibra basat en MYH (PC1) tenen un paper important en la regulació de l'heterogeneïtat de la fibra muscular esquelètica. L'anàlisi de sobrerepresentació dels principals impulsors en PC1 va revelar que la variabilitat en PC1 estava determinada principalment per l'adhesió cèl·lula-cèl·lula i el contingut de ribosomes al transcriptoma, i els cotàmers i les proteïnes ribosòmiques al proteoma (Figura 2B i Figures suplementàries 6D-E, Conjunt de dades suplementàries 7). En el múscul esquelètic, els cotàmers connecten el disc Z amb el sarcolema i participen en la transmissió i la senyalització de la força. 25 Els gràfics PCA anotats utilitzant característiques d'adhesió cèl·lula-cèl·lula (transcriptoma, Figura 2C) i cotàmers (proteoma, Figura 2D) van revelar un fort desplaçament a l'esquerra en PC1, cosa que indica que aquestes característiques estan enriquides en certes fibres.
Un examen més detallat de l'agrupació de miofibres a nivell UMAP va revelar que la majoria de les característiques presentaven un gradient d'expressió basat en MYH independent del tipus de miofibra en lloc d'un subgrup de miofibres específic. Aquesta continuïtat es va observar per a diversos gens associats amb afeccions patològiques (Figura 2E), com ara CHCHD10 (malaltia neuromuscular), SLIT3 (atròfia muscular) i CTDNEP1 (malaltia muscular). Aquesta continuïtat també es va observar a través del proteoma, incloent-hi proteïnes associades amb trastorns neurològics (UGDH), senyalització d'insulina (PHIP) i transcripció (HIST1H2AB) (Figura 2F). Col·lectivament, aquestes dades indiquen continuïtat en l'heterogeneïtat de contracció lenta/ràpida independent del tipus de fibra a través de diferents miofibres.
Curiosament, els gens impulsors de PC2 van mostrar una bona correlació entre el transcriptoma i el proteoma (r = 0,663) (Figura 2G), cosa que suggereix que els tipus de fibres de contracció lenta i ràpida, i en particular les propietats contràctils i metabòliques de les fibres musculars esquelètiques, estan regulades transcripcionalment. Tanmateix, els gens impulsors de PC1 no van mostrar cap correlació entre el transcriptoma i el proteoma (r = -0,027) (Figura 2H), cosa que suggereix que les variacions no relacionades amb els tipus de fibres de contracció lenta/ràpida estan regulades en gran mesura posttranscripcionalment. Com que les variacions de PC1 s'explicaven principalment per termes d'ontologia gènica ribosòmica, i atès que els ribosomes tenen un paper crucial i especialitzat a la cèl·lula participant activament i influint en la traducció de proteïnes,31 a continuació ens vam proposar investigar aquesta heterogeneïtat ribosòmica inesperada.
Primer vam acolorir el gràfic d'anàlisi de components principals de la proteòmica segons l'abundància relativa de proteïnes en el terme GOCC "ribosoma citoplasmàtic" (Figura 3A). Tot i que aquest terme està enriquit al costat positiu de PC1, donant lloc a un petit gradient, les proteïnes ribosòmiques impulsen la partició en ambdues direccions de PC1 (Figura 3A). Les proteïnes ribosòmiques enriquides al costat negatiu de PC1 incloïen RPL18, RPS18 i RPS13 (Figura 3B), mentre que RPL31, RPL35 i RPL38 (Figura 3C) van ser les principals impulsores del costat positiu de PC1. Curiosament, RPL38 i RPS13 s'expressaven molt en el múscul esquelètic en comparació amb altres teixits (Figura suplementària 7A). Aquestes signatures ribosòmiques distintives en PC1 no es van observar al transcriptoma (Figura suplementària 7B), cosa que indica regulació post-transcripcional.
A. Gràfic d'anàlisi de components principals (PCA) acolorit segons els termes de l'ontologia gènica ribosòmica citoplasmàtica (GO) a través del proteoma. Les fletxes indiquen la direcció de la variació mediada per proteïnes al gràfic PCA. La longitud de la línia correspon a la puntuació del component principal per a una proteïna determinada. B, C. Gràfics de característiques PCA per a RPS13 i RPL38. D. Anàlisi de clústers jeràrquics no supervisats de proteïnes ribosòmiques citoplasmàtiques. E. Model estructural del ribosoma 80S (PDB: 4V6X) que destaca les proteïnes ribosòmiques amb diferents abundàncies a les fibres musculars esquelètiques. F. Proteïnes ribosòmiques amb diferent estequiometria localitzades prop del canal de sortida de l'ARNm.
Els conceptes d'heterogeneïtat i especialització ribosòmiques s'han proposat anteriorment, segons els quals la presència de subpoblacions de ribosomes diferents (heterogeneïtat ribosòmica) pot influir directament en la traducció de proteïnes en diferents teixits32 i cèl·lules33 mitjançant la traducció selectiva de conjunts de transcrits d'ARNm específics34 (especialització ribosòmica). Per identificar subpoblacions de proteïnes ribosòmiques coexpressades en fibres musculars esquelètiques, vam realitzar una anàlisi de clústers jeràrquics no supervisats de proteïnes ribosòmiques al proteoma (Figura 3D, Conjunt de dades suplementàries 8). Com s'esperava, les proteïnes ribosòmiques no es van agrupar per tipus de fibra en funció de MYH. Tanmateix, vam identificar tres clústers diferents de proteïnes ribosòmiques; el primer clúster (clúster_ribosòmic_1) està coregulat amb RPL38 i, per tant, té una expressió augmentada en fibres amb un perfil PC1 positiu. El segon clúster (clúster_ribosòmic_2) està coregulat amb RPS13 i està elevat en fibres amb un perfil PC1 negatiu. El tercer clúster (clúster_ribosòmic_3) no mostra una expressió diferencial coordinada en les fibres musculars esquelètiques i es pot considerar la proteïna ribosòmica "central" del múscul esquelètic. Tant els clústers ribosòmics 1 com 2 contenen proteïnes ribosòmiques que anteriorment s'ha demostrat que regulen la traducció alternativa (per exemple, RPL10A, RPL38, RPS19 i RPS25) i influeixen funcionalment en el desenvolupament (per exemple, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 D'acord amb els resultats de la PCA, la representació heterogènia observada d'aquestes proteïnes ribosòmiques a través de les fibres també va mostrar continuïtat (Figura suplementària 7C).
Per visualitzar la ubicació de proteïnes ribosòmiques heterogènies dins del ribosoma, vam utilitzar un model estructural del ribosoma 80S humà (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Després d'aïllar proteïnes ribosòmiques pertanyents a diferents clústers ribosòmics, les seves ubicacions no estaven estretament alineades, cosa que suggereix que el nostre enfocament no va proporcionar enriquiment per a certes regions/fraccions del ribosoma. Curiosament, però, la proporció de proteïnes de subunitats grans al clúster 2 va ser menor que als clústers 1 i 3 (Figura suplementària 7D). Vam observar que les proteïnes amb estequiometria alterada a les fibres musculars esquelètiques es localitzaven predominantment a la superfície del ribosoma (Figura 3E), cosa que concorda amb la seva capacitat d'interactuar amb elements interns del lloc d'entrada del ribosome (IRES) en diferents poblacions d'ARNm, coordinant així la traducció selectiva. 40, 41 A més, moltes proteïnes amb estequiometria alterada a les fibres musculars esquelètiques es van localitzar a prop de regions funcionals com el túnel de sortida de l'ARNm (Figura 3F), que regulen selectivament l'elongació traduccional i l'aturada de pèptids específics. 42 En resum, les nostres dades suggereixen que l'estequiometria de les proteïnes ribosòmiques del múscul esquelètic presenta heterogeneïtat, la qual cosa resulta en diferències entre les fibres musculars esquelètiques.
A continuació, ens vam proposar identificar signatures de fibres de contracció ràpida i lenta i explorar els mecanismes de la seva regulació transcripcional. Comparant els clústers de fibres de contracció ràpida i lenta definits per UMAP en els dos conjunts de dades (Figures 1G-H i 4A-B), les anàlisis transcriptòmiques i proteòmiques van identificar 1366 i 804 característiques diferencialment abundants, respectivament (Figures 4A-B, Conjunts de dades suplementaris 9-12). Vam observar les diferències esperades en les signatures relacionades amb els sarcòmers (per exemple, tropomiosina i troponina), l'acoblament d'excitació-contracció (isoformes SERCA) i el metabolisme energètic (per exemple, ALDOA i CKB). A més, els transcrits i les proteïnes que regulen la ubiquitinació de proteïnes es van expressar diferencialment en fibres de contracció ràpida i lenta (per exemple, USP54, SH3RF2, USP28 i USP48) (Figures 4A-B). A més, el gen de la proteïna microbiana RP11-451G4.2 (DWORF), que anteriorment s'ha demostrat que s'expressa diferencialment en els tipus de fibra muscular de xai43 i millora l'activitat SERCA en el múscul cardíac44, es va sobreexpressar significativament en les fibres musculars esquelètiques lentes (Figura 4A). De la mateixa manera, a nivell de fibra individual, es van observar diferències significatives en signatures conegudes com ara les isoformes de la lactat deshidrogenasa relacionades amb el metabolisme (LDHA i LDHB, Figura 4C i Figura Suplementària 8A)45,46, així com signatures específiques del tipus de fibra prèviament desconegudes (com ara IRX3, USP54, USP28 i DPYSL3) (Figura 4C). Hi va haver una superposició significativa de característiques expressades diferencialment entre els conjunts de dades transcriptòmiques i proteòmiques (Figura Suplementària 8B), així com una correlació de canvi de plec impulsada principalment per l'expressió diferencial més pronunciada de les característiques del sarcòmer (Figura Suplementària 8C). Cal destacar que algunes signatures (per exemple, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) van mostrar una forta regulació post-transcripcional només a nivell proteòmic i tenien perfils d'expressió específics del tipus de fibra de contracció lenta/ràpida (Figura suplementària 8C).
Gràfics de volcans A i B que comparen cúmuls lents i ràpids identificats pels gràfics d'aproximació i projecció de varietat uniforme (UMAP) a les figures 1G-H. Els punts de colors representen transcrits o proteïnes que són significativament diferents a FDR < 0,05, i els punts més foscos representen transcrits o proteïnes que són significativament diferents a un canvi logarítmic > 1. L'anàlisi estadística bidireccional es va realitzar mitjançant la prova Wald DESeq2 amb valors p ajustats per Benjamini-Hochberg (transcriptòmica) o el mètode del model lineal de Limma amb anàlisi bayesiana empírica seguida d'ajust de Benjamini-Hochberg per a comparacions múltiples (proteòmica). C Gràfics de signatura de gens o proteïnes seleccionats amb expressió diferencial entre fibres lentes i ràpides. D Anàlisi d'enriquiment de transcrits i proteïnes amb expressió diferencial significativa. Els valors superposats s'enriqueixen en ambdós conjunts de dades, els valors del transcriptoma s'enriqueixen només en el transcriptoma i els valors del proteoma s'enriqueixen només en el proteoma. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant el paquet clusterProfiler amb valors p ajustats per Benjamini-Hochberg. E. Factors de transcripció específics del tipus de fibra identificats per SCENIC basant-se en puntuacions d'especificitat reguladora derivades de SCENIC i expressió diferencial d'ARNm entre tipus de fibra. F. Perfils de factors de transcripció seleccionats amb expressió diferencial entre fibres lentes i ràpides.
A continuació, vam realitzar una anàlisi de sobrerepresentació de gens i proteïnes representats diferencialment (Figura 4D, Conjunt de dades suplementàries 13). L'enriquiment de vies per a característiques que diferien entre els dos conjunts de dades va revelar diferències esperades, com ara processos de β-oxidació d'àcids grassos i metabolisme de cetones (fibres lentes), contracció de miofilaments/musculars (fibres ràpides i lentes, respectivament) i processos catabòlics de carbohidrats (fibres ràpides). L'activitat de la proteïna fosfatasa de serina/treonina també es va elevar en les fibres ràpides, impulsada per característiques com les subunitats reguladores i catalítiques de la fosfatasa (PPP3CB, PPP1R3D i PPP1R3A), que se sap que regulen el metabolisme del glicogen (47) (Figures suplementàries 8D-E). Altres vies enriquides en fibres ràpides van incloure cossos de processament (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) al proteoma (Figura suplementària 8F), potencialment implicats en la regulació post-transcripcional (48), i l'activitat dels factors de transcripció (SREBF1, RXRG, RORA) al transcriptoma (Figura suplementària 8G). Les fibres lentes es van enriquir en activitat oxidoreductasa (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura suplementària 8H), unió a amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura suplementària 8I), matriu extracel·lular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura suplementària 8J) i activitat receptor-lligand (FNDC5, SPX, NENF) (Figura suplementària 8K).
Per obtenir més informació sobre la regulació transcripcional subjacent a les característiques del tipus de fibra muscular lenta/ràpida, vam realitzar una anàlisi d'enriquiment de factors de transcripció mitjançant SCENIC49 (Conjunt de dades suplementàries 14). Molts factors de transcripció es van enriquir significativament entre les fibres musculars ràpides i lentes (Figura 4E). Això incloïa factors de transcripció com ara MAFA, que anteriorment s'havia relacionat amb el desenvolupament ràpid de fibres musculars,50 així com diversos factors de transcripció que no s'havien associat prèviament amb programes gènics específics del tipus de fibra muscular. Entre aquests, PITX1, EGR1 i MYF6 van ser els factors de transcripció més enriquits en les fibres musculars ràpides (Figura 4E). En canvi, ZSCAN30 i EPAS1 (també conegut com a HIF2A) van ser els factors de transcripció més enriquits en les fibres musculars lentes (Figura 4E). D'acord amb això, MAFA es va expressar a nivells més alts a la regió UMAP corresponent a les fibres musculars ràpides, mentre que EPAS1 tenia el patró d'expressió oposat (Figura 4F).
A més dels gens codificants de proteïnes coneguts, hi ha nombrosos biotipus d'ARN no codificants que poden estar implicats en la regulació del desenvolupament i les malalties humanes. 51, 52 En els conjunts de dades del transcriptoma, diversos ARN no codificants presenten especificitat de tipus de fibra (Figura 5A i Conjunt de dades suplementari 15), inclòs el LINC01405, que és altament específic per a les fibres lentes i s'ha informat que està disminuït en el múscul de pacients amb miopatia mitocondrial. 53 En canvi, RP11-255P5.3, corresponent al gen lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, presenta especificitat de tipus de fibra ràpida. Tant LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) com RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) presenten especificitat del múscul esquelètic (figures suplementàries 9A-B) i no tenen gens contràctils coneguts dins del seu veïnat genòmic d'1 Mb, cosa que suggereix que tenen un paper especialitzat en la regulació dels tipus de fibres en lloc de la regulació dels gens contràctils veïns. Els perfils d'expressió específics del tipus de fibra lenta/ràpida de LINC01405 i RP11-255P5.3, respectivament, es van confirmar mitjançant RNAscope (figures 5B-C).
A. Els transcrits d'ARN no codificant estan regulats significativament en les fibres musculars de contracció lenta i ràpida. B. Imatges representatives de RNAscope que mostren l'especificitat del tipus de fibra de contracció lenta i ràpida de LINC01405 i RP11-255P5.3, respectivament. Barra d'escala = 50 μm. C. Quantificació de l'expressió d'ARN no codificant específica del tipus de miofibra determinada per RNAscope (n = 3 biòpsies d'individus independents, comparant fibres musculars ràpides i lentes dins de cada individu). L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant una prova t de Student bilateral. Els diagrames de caixa mostren la mediana i el primer i tercer quartils, amb els bigotis apuntant als valors mínim i màxim. D. Flux de treball d'identificació de proteïnes microbianes de novo (creat amb BioRender.com). E. La proteïna microbiana LINC01405_ORF408:17441:17358 s'expressa específicament en fibres musculars esquelètiques lentes (n = 5 biòpsies de participants independents, comparant fibres musculars ràpides i lentes en cada participant). L'anàlisi estadística es va dur a terme utilitzant el mètode del model lineal de Limm combinat amb un enfocament bayesià empíric, seguit del mètode de Benjamini-Hochberg per a comparacions múltiples amb ajust del valor p. Els diagrames de caixa mostren la mediana, el primer i el tercer quartil, amb els bigotis que apunten als valors màxims/mínims.
Recentment, estudis han demostrat que moltes suposades transcripcions no codificants codifiquen proteïnes microbianes transcrites, algunes de les quals regulen la funció muscular.44, 55 Per identificar proteïnes microbianes amb potencial especificitat de tipus de fibra, vam cercar al nostre conjunt de dades de proteomes de 1000 fibres utilitzant un fitxer FASTA personalitzat que conté les seqüències de transcripcions no codificants (n = 305) que es troben al conjunt de dades de transcripcions de 1000 fibres (Figura 5D). Vam identificar 197 proteïnes microbianes de 22 transcripcions diferents, 71 de les quals estaven regulades diferencialment entre fibres musculars esquelètiques lentes i ràpides (Figura suplementària 9C i Conjunt de dades suplementari 16). Per a LINC01405, es van identificar tres productes proteics microbians, un dels quals va mostrar una especificitat de fibra lenta similar a la seva transcripció (Figura 5E i Figura suplementària 9D). Per tant, vam identificar LINC01405 com un gen que codifica una proteïna microbiana específica per a fibres musculars esquelètiques lentes.
Vam desenvolupar un flux de treball complet per a la caracterització proteòmica a gran escala de fibres musculars individuals i vam identificar reguladors de l'heterogeneïtat de les fibres en estats sans. Vam aplicar aquest flux de treball per entendre com les miopaties nemalines afecten l'heterogeneïtat de les fibres musculars esquelètiques. Les miopaties nemalines són malalties musculars hereditàries que causen debilitat muscular i, en els nens afectats, presenten una sèrie de complicacions que inclouen dificultat respiratòria, escoliosi i mobilitat limitada de les extremitats. 19,20 Normalment, en les miopaties nemalines, les variants patogèniques en gens com l'actina alfa 1 (ACTA1) donen lloc a un predomini de la composició de miofibres de fibres de contracció lenta, tot i que aquest efecte és heterogeni. Una excepció notable és la miopatia nemalínica per troponina T1 (TNNT1), que té un predomini de fibres ràpides. Per tant, una millor comprensió de l'heterogeneïtat subjacent a la desregulació de les fibres musculars esquelètiques observada en les miopaties nemalines pot ajudar a desentranyar la complexa relació entre aquestes malalties i el tipus de miofibra.
En comparació amb els controls sans (n ​​= 3 per grup), les miofibres aïllades de pacients amb miopatia nemalínica amb mutacions en els gens ACTA1 i TNNT1 van mostrar una atròfia o distròfia marcada de les miofibres (Figura 6A, Taula suplementària 3). Això va presentar reptes tècnics significatius per a l'anàlisi proteòmica a causa de la quantitat limitada de material disponible. Malgrat això, vam poder detectar 2485 proteïnes en 272 miofibres esquelètiques. Després de filtrar almenys 1000 proteïnes quantificades per fibra, 250 fibres van ser sotmeses a una anàlisi bioinformàtica posterior. Després del filtratge, es va quantificar una mitjana de 1573 ± 359 proteïnes per fibra (Figura suplementària 10A, Conjunts de dades suplementàries 17-18). Cal destacar que, malgrat la reducció significativa de la mida de la fibra, la profunditat del proteoma de les mostres de pacients amb miopatia nemalínica només es va reduir modestament. A més, el processament d'aquestes dades mitjançant els nostres propis fitxers FASTA (incloses les transcripcions no codificants) ens va permetre identificar cinc proteïnes microbianes en miofibres esquelètiques de pacients amb miopatia nemalínica (Conjunt de dades suplementari 19). El rang dinàmic del proteoma era significativament més ampli, i les proteïnes totals del grup de control es van correlacionar bé amb els resultats d'una anàlisi prèvia del proteoma de 1000 fibres (Fig. suplementària 10B-C).
A. Imatges microscòpiques que mostren atròfia o distròfia de fibres i el predomini de diferents tipus de fibres basades en MYH en miopaties nemalíniques (NM) ACTA1 i TNNT1. Barra d'escala = 100 μm. Per garantir la reproductibilitat de la tinció en pacients amb ACTA1 i TNNT1, es van tenyir tres biòpsies de pacients de dues a tres vegades (quatre seccions per cas) abans de seleccionar imatges representatives. B. Proporcions del tipus de fibra en els participants basades en MYH. C. Gràfic d'anàlisi de components principals (PCA) de fibres musculars esquelètiques en pacients amb miopaties nemalíniques i controls. D. Fibres musculars esquelètiques de pacients amb miopaties nemalíniques i controls projectades en un gràfic PCA determinat a partir de les 1000 fibres analitzades a la Figura 2. Per exemple, gràfics de volcà que comparen diferències entre participants amb miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1 i controls, i entre participants amb miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1. Els cercles de colors indiquen proteïnes que eren significativament diferents a π < 0,05, i els punts foscos indiquen proteïnes que eren significativament diferents a FDR < 0,05. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant el mètode del model lineal de Limma i mètodes bayesians empírics, seguit d'un ajust del valor p per a comparacions múltiples mitjançant el mètode de Benjamini-Hochberg. H. Anàlisi d'enriquiment de proteïnes expressades diferencialment de manera significativa a tot el proteoma i en fibres de tipus 1 i 2A. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant el paquet clusterProfiler i valors p ajustats per Benjamini-Hochberg. I, J. Gràfics d'anàlisi de components principals (PCA) acolorits per termes de matriu extracel·lular i ontologia gènica mitocondrial (GO).
Com que les miopaties nemalíniques poden influir en la proporció de tipus de miofibres que expressen MYH en el múscul esquelètic,19,20 primer vam examinar els tipus de miofibres que expressen MYH en pacients amb miopaties nemalíniques i controls. Vam determinar el tipus de miofibres utilitzant un mètode imparcial descrit anteriorment per a l'assaig de 1000 miofibres (Figs suplementàries 10D-E) i, de nou, no vam aconseguir identificar miofibres 2X pures (Figura 6B). Vam observar un efecte heterogeni de les miopaties nemalíniques sobre el tipus de miofibres, ja que dos pacients amb mutacions ACTA1 tenien una proporció més gran de miofibres de tipus 1, mentre que dos pacients amb miopatia nemalínica TNNT1 tenien una proporció disminuïda de miofibres de tipus 1 (Figura 6B). De fet, l'expressió de les isoformes MYH2 i de la troponina ràpida (TNNC2, TNNI2 i TNNT3) va disminuir en les miopaties ACTA1-nemalina, mentre que l'expressió MYH7 va disminuir en les miopaties TNNT1-nemalina (Figura suplementària 11A). Això és coherent amb informes anteriors de canvi heterogeni de tipus de miofibres en miopaties nemalines.19,20 Vam confirmar aquests resultats mitjançant immunohistoquímica i vam trobar que els pacients amb miopatia ACTA1-nemalina tenien un predomini de miofibres de tipus 1, mentre que els pacients amb miopatia TNNT1-nemalina tenien el patró oposat (Figura 6A).
A nivell del proteoma d'una sola fibra, les fibres musculars esquelètiques dels pacients amb miopatia nemalínica ACTA1 i TNNT1 es van agrupar amb la majoria de les fibres de control, i les fibres amb miopatia nemalínica TNNT1 van ser generalment les més afectades (Figura 6C). Això va ser particularment evident en representar els gràfics d'anàlisi de components principals (PCA) de fibres pseudoinflades per a cada pacient, i els pacients amb miopatia nemalínica TNNT1 2 i 3 van semblar els més distants de les mostres de control (Figura suplementària 11B, Conjunt de dades suplementàries 20). Per entendre millor com es comparen les fibres dels pacients amb miopatia amb les fibres sanes, vam utilitzar informació detallada obtinguda de l'anàlisi proteòmica de 1.000 fibres de participants adults sans. Vam projectar fibres del conjunt de dades de miopatia (pacients i controls amb miopatia nemalínica ACTA1 i TNNT1) al gràfic PCA obtingut de l'anàlisi proteòmica de 1.000 fibres (Figura 6D). La distribució dels tipus de fibres MYH al llarg de PC2 en les fibres de control va ser similar a la distribució de fibres obtinguda de l'anàlisi proteòmica de 1000 fibres. No obstant això, la majoria de les fibres en pacients amb miopatia nemalínica es van desplaçar cap avall de PC2, superposant-se amb fibres sanes de contracció ràpida, independentment del seu tipus de fibra MYH nativa. Així, tot i que els pacients amb miopatia nemalínica ACTA1 van mostrar un desplaçament cap a les fibres de tipus 1 quan es van quantificar mitjançant mètodes basats en MYH, tant la miopatia nemalínica ACTA1 com la miopatia nemalínica TNNT1 van desplaçar el proteoma de la fibra muscular esquelètica cap a les fibres de contracció ràpida.
A continuació, vam comparar directament cada grup de pacients amb controls sans i vam identificar 256 i 552 proteïnes amb expressió diferencial en miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1, respectivament (Figura 6E-G i Figura Suplementària 11C, Conjunt de Dades Suplementàries 21). L'anàlisi d'enriquiment gènic va revelar una disminució coordinada de les proteïnes mitocondrials (Figura 6H-I, Conjunt de Dades Suplementàries 22). Sorprenentment, malgrat el predomini diferencial dels tipus de fibra en miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1, aquesta disminució va ser completament independent del tipus de fibra basat en MYH (Figura 6H i Figures Suplementàries 11D-I, Conjunt de Dades Suplementàries 23). També es van regular tres proteïnes microbianes en miopaties nemalíniques ACTA1 o TNNT1. Dues d'aquestes microproteïnes, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (també coneguda com a LINC00598 o Lnc-FOXO1) i ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), van mostrar una abundància diferencial només en miofibres de tipus 1. Anteriorment s'ha informat que ENSG00000215483_TR14_ORF67 juga un paper en la regulació del cicle cel·lular.56 D'altra banda, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (corresponent a LINC01798) es va incrementar tant en miofibres de tipus 1 com de tipus 2A en miopatia ACTA1-nemalina en comparació amb controls sans (Figura suplementària 12A, Conjunt de dades suplementàries 24). En canvi, les proteïnes ribosòmiques no es van veure afectades en gran mesura per la miopatia nemalínica, tot i que RPS17 estava regulat a la baixa en la miopatia nemalínica ACTA1 (Fig. 6E).
L'anàlisi d'enriquiment també va revelar una regulació a l'alça dels processos del sistema immunitari en les miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1, mentre que l'adhesió cel·lular també va augmentar en la miopatia nemalínica TNNT1 (Figura 6H). L'enriquiment d'aquests factors extracel·lulars es va reflectir en les proteïnes de la matriu extracel·lular que van desplaçar PCA a PC1 i PC2 en una direcció negativa (és a dir, cap a les fibres més afectades) (Figura 6J). Ambdós grups de pacients van mostrar una major expressió de proteïnes extracel·lulars implicades en les respostes immunitàries i els mecanismes de reparació sarcolemal, com ara les annexines (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 i la seva proteïna interactiva S100A1159 (Figures suplementàries 12B-C). S'ha informat anteriorment que aquest procés es veu millorat en les distròfies musculars60 però, segons el nostre coneixement, no s'ha associat prèviament amb miopaties nemalíniques. La funció normal d'aquesta maquinària molecular és necessària per a la reparació sarcolemal després d'una lesió i per a la fusió dels miòcits recentment formats amb les miofibres58,61. Així doncs, l'augment de l'activitat d'aquest procés en ambdós grups de pacients suggereix una resposta reparativa a lesions causades per la inestabilitat de les miofibres.
Els efectes de cada miopatia nemalínica estaven ben correlacionats (r = 0,736) i mostraven una superposició raonable (Figures suplementàries 11A-B), cosa que indica que la miopatia nemalínica ACTA1 i TNNT1 tenen efectes similars sobre el proteoma. Tanmateix, algunes proteïnes només estaven regulades en la miopatia nemalínica ACTA1 o TNNT1 (Figures suplementàries 11A i C). La proteïna profibròtica MFAP4 va ser una de les proteïnes més regulades a l'alça en la miopatia nemalínica TNNT1, però va romandre sense canvis en la miopatia nemalínica ACTA1. SKIC8, un component del complex PAF1C responsable de regular la transcripció del gen HOX, estava regulat a la baixa en la miopatia nemalínica TNNT1, però no es va veure afectat en la miopatia nemalínica ACTA1 (Figura suplementària 11A). La comparació directa de la miopatia nemalínica ACTA1 i TNNT1 va revelar majors reduccions en les proteïnes mitocondrials i augments en les proteïnes del sistema immunitari en la miopatia nemalínica TNNT1 (Figura 6G-H i Figures suplementàries 11C i 11H-I). Aquestes dades són consistents amb la major atròfia/distròfia observada en la miopatia nemalínica TNNT1 en comparació amb la miopatia nemalínica TNNT1 (Figura 6A), cosa que suggereix que la miopatia nemalínica TNNT1 representa una forma més greu de la malaltia.
Per avaluar si els efectes observats de la miopatia nemalínica persisteixen a nivell de tot el múscul, vam realitzar una anàlisi proteòmica a granel de biòpsies musculars de la mateixa cohort de pacients amb miopatia nemalínica TNNT1 i els vam comparar amb els controls (n = 3 per grup) (Fig. suplementària 13A, Conjunt de dades suplementari 25). Com era d'esperar, els controls estaven estretament relacionats en l'anàlisi de components principals, mentre que els pacients amb miopatia nemalínica TNNT1 van mostrar una variabilitat entre mostres més alta, similar a la que es va observar en l'anàlisi de fibra única (Fig. suplementària 13B). L'anàlisi a granel va reproduir les proteïnes expressades diferencialment (Fig. suplementària 13C, Conjunt de dades suplementari 26) i els processos biològics (Fig. suplementària 13D, Conjunt de dades suplementari 27) destacats comparant fibres individuals, però va perdre la capacitat de distingir entre diferents tipus de fibres i no va tenir en compte els efectes heterogenis de la malaltia entre les fibres.
En conjunt, aquestes dades demostren que la proteòmica d'una sola miofibra pot elucidar característiques biològiques clíniques que no es poden detectar mitjançant mètodes dirigits com la immunotransferència. A més, aquestes dades destaquen les limitacions d'utilitzar la tipificació de fibres d'actina (MYH) per si sola per descriure l'adaptació fenotípica. De fet, tot i que el canvi de tipus de fibra difereix entre les miopaties nemalines d'actina i troponina, ambdues miopaties nemalines desacoblen la tipificació de fibres MYH del metabolisme de les fibres musculars esquelètiques cap a un proteoma muscular més ràpid i menys oxidatiu.
L'heterogeneïtat cel·lular és fonamental perquè els teixits satisfacin les seves diverses demandes. En el múscul esquelètic, això sovint es descriu com a tipus de fibres caracteritzades per diferents graus de producció de força i fatigabilitat. Tanmateix, és clar que això només explica una petita part de la variabilitat de les fibres musculars esquelètiques, que és molt més variable, complexa i multifacètica del que es pensava anteriorment. Els avenços tecnològics han il·lustrat els factors que regulen les fibres musculars esquelètiques. De fet, les nostres dades suggereixen que les fibres de tipus 2X poden no ser un subtipus diferent de fibra muscular esquelètica. A més, vam identificar proteïnes metabòliques, proteïnes ribosòmiques i proteïnes associades a cèl·lules com a determinants principals de l'heterogeneïtat de les fibres musculars esquelètiques. En aplicar el nostre flux de treball proteòmic a mostres de pacients amb miopatia per nematodes, vam demostrar a més que la tipificació de fibres basada en MYH no reflecteix completament l'heterogeneïtat del múscul esquelètic, especialment quan el sistema està pertorbat. De fet, independentment del tipus de fibra basada en MYH, la miopatia per nematodes provoca un canvi cap a fibres més ràpides i menys oxidatives.
Les fibres musculars esquelètiques s'han classificat des del segle XIX. Les anàlisis òmiques recents ens han permès començar a comprendre els perfils d'expressió de diferents tipus de fibres MYH i les seves respostes a diferents estímuls. Com es descriu aquí, els enfocaments òmics també tenen l'avantatge d'una major sensibilitat per quantificar marcadors de tipus de fibra que els mètodes tradicionals basats en anticossos, sense dependre de la quantificació d'un sol (o uns quants) marcadors per definir un tipus de fibra muscular esquelètica. Vam utilitzar fluxos de treball transcriptòmics i proteòmics complementaris i vam integrar els resultats per examinar la regulació transcripcional i post-transcripcional de l'heterogeneïtat de les fibres en les fibres musculars esquelètiques humanes. Aquest flux de treball va provocar que no s'identifiquessin fibres pures de tipus 2X a nivell de proteïna en el vast lateral de la nostra cohort d'homes joves sans. Això és coherent amb estudis anteriors de fibra única que van trobar <1% de fibres 2X pures en vast lateral saludable, tot i que això s'hauria de confirmar en altres músculs en el futur. La discrepància entre la detecció de fibres 2X gairebé pures a nivell d'ARNm i només fibres 2A/2X mixtes a nivell de proteïna és desconcertant. L'expressió de l'ARNm de la isoforma MYH no és circadiana,67 cosa que suggereix que és poc probable que hàgim "perdut" el senyal d'inici de MYH2 en fibres 2X aparentment pures a nivell d'ARN. Una possible explicació, tot i que purament hipotètica, podria ser les diferències en l'estabilitat de les proteïnes i/o l'ARNm entre les isoformes de MYH. De fet, cap fibra ràpida és 100% pura per a cap isoforma de MYH, i no està clar si els nivells d'expressió de l'ARNm de MYH1 en el rang del 70-90% donarien lloc a una abundància igual de MYH1 i MYH2 a nivell de proteïna. Tanmateix, quan es considera tot el transcriptoma o proteoma, l'anàlisi de clústers només pot identificar amb confiança dos clústers diferents que representen fibres musculars esquelètiques lentes i ràpides, independentment de la seva composició precisa de MYH. Això és coherent amb les anàlisis que utilitzen enfocaments transcriptòmics d'un sol nucli, que normalment identifiquen només dos clústers mionuclears diferents. 68, 69, 70 A més, tot i que estudis proteòmics anteriors han identificat fibres de tipus 2X, aquestes fibres no s'agrupen separadament de la resta de fibres ràpides i només mostren un petit nombre de proteïnes diferencialment abundants en comparació amb altres tipus de fibres basades en MYH. 14 Aquests resultats suggereixen que hauríem de tornar a la visió de principis del segle XX de la classificació de les fibres musculars, que dividia les fibres musculars esquelètiques humanes no en tres classes diferents basades en MYH, sinó en dos grups basats en les seves propietats metabòliques i contràctils. 63
Més important encara, l'heterogeneïtat de les miofibres s'ha de considerar al llarg de múltiples dimensions. Estudis "òmics" anteriors han apuntat en aquesta direcció, suggerint que les fibres musculars esquelètiques no formen grups discrets sinó que estan disposades al llarg d'un continu. 11, 13, 14, 64, 71 Aquí mostrem que, a més de les diferències en les propietats contràctils i metabòliques del múscul esquelètic, les miofibres es poden diferenciar per característiques relacionades amb les interaccions cèl·lula-cèl·lula i els mecanismes de traducció. De fet, hem trobat heterogeneïtat de ribosomes en les fibres musculars esquelètiques que contribueix a l'heterogeneïtat independentment dels tipus de fibra lenta i ràpida. La causa subjacent d'aquesta heterogeneïtat substancial de miofibres, independent del tipus de fibra lenta i ràpida, continua sense estar clara, però pot apuntar a una organització espacial especialitzada dins dels fascicles musculars que responen de manera òptima a forces i càrregues específiques,72 a una comunicació cel·lular o específica d'òrgans especialitzada amb altres tipus de cèl·lules en el microambient muscular73,74,75 o a diferències en l'activitat dels ribosomes dins de les miofibres individuals. De fet, s'ha demostrat que l'heteroplasmia ribosòmica, ja sigui mitjançant la substitució paràloga de RPL3 i RPL3L o al nivell de 2'O-metilació de l'ARNr, està associada amb la hipertròfia del múscul esquelètic76,77. Les aplicacions multiòmiques i espacials combinades amb la caracterització funcional de miofibres individuals faran avançar encara més la nostra comprensió de la biologia muscular a nivell multiòmic78.
Analitzant els proteomes de miofibres individuals de pacients amb miopaties nemalíniques, també vam demostrar la utilitat, l'eficàcia i l'aplicabilitat de la proteòmica de miofibres individuals per elucidar la fisiopatologia clínica del múscul esquelètic. A més, comparant el nostre flux de treball amb l'anàlisi proteòmica global, vam poder demostrar que la proteòmica de miofibres individuals proporciona la mateixa profunditat d'informació que la proteòmica tissular global i estén aquesta profunditat tenint en compte l'heterogeneïtat interfibrària i el tipus de miofibra. A més de les diferències esperades (encara que variables) en la relació de tipus de fibra observades en les miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1 en comparació amb els controls sans,19 també vam observar una remodelació oxidativa i extracel·lular independent del canvi de tipus de fibra mediat per MYH. La fibrosi s'ha descrit anteriorment en miopaties nemalíniques TNNT1.19 Tanmateix, la nostra anàlisi es basa en aquesta troballa i també revela nivells elevats de proteïnes relacionades amb l'estrès secretades extracel·lularment, com ara les annexines, implicades en els mecanismes de reparació sarcolemal, en miofibres de pacients amb miopaties nemalíniques ACTA1 i TNNT1.57,58,59 En conclusió, l'augment dels nivells d'annexina en miofibres de pacients amb miopatia nemalínica pot representar una resposta cel·lular per reparar miofibres greument atròfiques.
Tot i que aquest estudi representa l'anàlisi més gran de fibra única de múscul-òmica completa en humans fins ara, no està exempt de limitacions. Vam aïllar fibres musculars esquelètiques d'una mostra relativament petita i homogènia de participants i d'un sol múscul (el vast lateral). Per tant, és impossible excloure l'existència de poblacions de fibres específiques en tots els tipus de músculs i en els extrems de la fisiologia muscular. Per exemple, no podem excloure la possibilitat que aparegui un subconjunt de fibres ultraràpides (per exemple, fibres 2X pures) en velocistes i/o atletes de força altament entrenats79 o durant períodes d'inactivitat muscular66,80. A més, la mida limitada de la mostra de participants ens va impedir investigar les diferències de sexe en l'heterogeneïtat de les fibres, ja que se sap que les proporcions de tipus de fibra difereixen entre homes i dones. A més, no vam poder dur a terme anàlisis transcriptòmiques i proteòmiques sobre les mateixes fibres musculars o mostres dels mateixos participants. A mesura que nosaltres i altres continuem optimitzant les anàlisis de cèl·lules individuals i de miofibres individuals mitjançant l'anàlisi òmica per aconseguir una entrada de mostra ultrabaixa (com es demostra aquí en l'anàlisi de fibres de pacients amb miopatia mitocondrial), l'oportunitat de combinar enfocaments multiòmics (i funcionals) dins de fibres musculars individuals es fa evident.
En general, les nostres dades identifiquen i expliquen els factors transcripcionals i postranscripcionals de l'heterogeneïtat del múscul esquelètic. En concret, presentem dades que desafien un dogma de llarga data en la fisiologia del múscul esquelètic associat amb la definició clàssica dels tipus de fibres basada en la teoria de la hipersensibilitat multiforme (MYH). Esperem renovar el debat i, en última instància, repensar la nostra comprensió de la classificació i l'heterogeneïtat de les fibres del múscul esquelètic.
Catorze participants caucàsics (12 homes i 2 dones) van acceptar voluntàriament participar en aquest estudi. L'estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de l'Hospital Universitari de Gant (BC-10237), complia amb la Declaració de Hèlsinki de 2013 i es va registrar a ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Les característiques generals dels participants es presenten a la Taula Suplementària 1. Després d'obtenir el consentiment informat verbal i per escrit, els participants es van sotmetre a un examen mèdic abans de la inclusió final a l'estudi. Els participants eren joves (22-42 anys), sans (sense afeccions mèdiques, sense antecedents de tabaquisme) i moderadament actius físicament. La captació màxima d'oxigen es va determinar mitjançant un ergòmetre esglaonat per avaluar la forma física, tal com s'ha descrit anteriorment. 81
Es van recollir mostres de biòpsia muscular en repòs i en dejuni tres vegades, amb 14 dies de diferència. Com que aquestes mostres es van recollir com a part d'un estudi més ampli, els participants van consumir placebo (lactosa), un antagonista del receptor H1 (540 mg de fexofenadina) o un antagonista del receptor H2 (40 mg de famotidina) 40 minuts abans de la biòpsia. Prèviament hem demostrat que aquests antagonistes dels receptors d'histamina no afecten la forma física del múscul esquelètic en repòs81, i no es va observar cap agrupació relacionada amb l'estat als nostres gràfics de control de qualitat (figures suplementàries 3 i 6). Es va mantenir una dieta estandarditzada (41,4 kcal/kg de pes corporal, 5,1 g/kg de carbohidrats de pes corporal, 1,4 g/kg de proteïnes de pes corporal i 1,6 g/kg de greix de pes corporal) durant 48 hores abans de cada dia experimental, i es va consumir un esmorzar estandarditzat (1,5 g/kg de carbohidrats de pes corporal) al matí del dia experimental. Sota anestèsia local (0,5 ml de lidocaïna a l'1% sense epinefrina), es van obtenir biòpsies musculars del múscul vast lateral mitjançant aspiració percutània de Bergström.82 Les mostres musculars es van incloure immediatament en RNAlater i es van emmagatzemar a 4 °C fins a la dissecció manual de fibres (fins a 3 dies).
Els feixos de miofibres recentment aïllats es van transferir a un medi RNAlater fresc en una placa de cultiu. A continuació, les miofibres individuals es van disseccionar manualment mitjançant un estereomicroscopi i unes pinces fines. Es van disseccionar vint-i-cinc fibres de cada biòpsia, prestant especial atenció a la selecció de fibres de diferents zones de la biòpsia. Després de la dissecció, cada fibra es va submergir suaument en 3 μl de tampó de lisi (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) que contenia enzims proteinasa K i DNasa per eliminar proteïnes i ADN no desitjats. La lisi cel·lular i l'eliminació de proteïnes/ADN es van iniciar mitjançant un breu vòrtex, centrifugació del líquid en una microcentrífuga i incubació a temperatura ambient (10 min). El lisat es va incubar en un termociclador (T100, Bio-Rad) a 37 °C durant 5 min, 75 °C durant 5 min i després es va emmagatzemar immediatament a -80 °C fins al seu processament posterior.
Les biblioteques d'ARN poliadenilades compatibles amb Illumina es van preparar a partir de 2 µl de lisat de miofibres utilitzant el kit de preparació de biblioteques d'ARNm-Seq de QuantSeq-Pool 3′ (Lexogen). Els mètodes detallats es poden trobar al manual del fabricant. El procés comença amb la síntesi de cDNA de primera cadena per transcripció inversa, durant la qual s'introdueixen identificadors moleculars únics (UMI) i codis de barres i1 específics de la mostra per garantir l'agrupació de mostres i reduir la variabilitat tècnica durant el processament posterior. A continuació, l'ADNc de 96 miofibres s'agrupa i es purifica amb perles magnètiques, després de la qual cosa s'elimina l'ARN i es realitza la síntesi de segona cadena mitjançant encebadors aleatoris. La biblioteca es purifica amb perles magnètiques, s'afegeixen etiquetes i5/i7 específiques del grup i s'amplifica per PCR. Un pas final de purificació produeix biblioteques compatibles amb Illumina. La qualitat de cada grup de biblioteques es va avaluar mitjançant el kit d'anàlisi d'ADN de petits fragments d'alta sensibilitat (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Basant-se en la quantificació de Qubit, es van agrupar més grups a concentracions equimolars (2 nM). El grup resultant es va seqüenciar en un instrument NovaSeq 6000 en mode estàndard utilitzant el kit de reactius NovaSeq S2 (1 × 100 nucleòtids) amb una càrrega de 2 nM (4% de PhiX).
El nostre pipeline es basa en el pipeline d'anàlisi de dades QuantSeq Pool de Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Les dades es van desmultiplexar primer amb bcl2fastq2 (v2.20.0) basant-se en l'índex i7/i5. La lectura 2 es va desmultiplexar amb idemux (v0.1.6) basant-se en el codi de barres de la mostra i1 i les seqüències UMI es van extreure amb umi_tools (v1.0.1). Les lectures es van retallar amb cutadapt (v3.4) en múltiples rondes per eliminar lectures curtes (<20 de longitud) o lectures que consistien únicament en seqüències adaptadores. Les lectures es van alinear amb el genoma humà mitjançant STAR (v2.6.0c) i els fitxers BAM es van indexar amb SAMtools (v1.11). Les lectures duplicades es van eliminar mitjançant umi_tools (v1.0.1). Finalment, el recompte d'alineacions es va realitzar mitjançant featureCounts a Subread (v2.0.3). El control de qualitat es va dur a terme mitjançant FastQC (v0.11.9) en diverses etapes intermèdies del procés.
Tot el processament i la visualització bioinformàtica addicionals es van dur a terme a R (v4.2.3), principalment utilitzant el flux de treball Seurat (v4.4.0).83 Per tant, els valors UMI individuals i les matrius de metadades es van transformar en objectes Seurat. Es van eliminar els gens expressats en menys del 30% de totes les fibres. Les mostres de baixa qualitat es van eliminar en funció d'un llindar mínim de 1000 valors UMI i 1000 gens detectats. Finalment, 925 fibres van superar tots els passos de filtratge del control de qualitat. Els valors UMI es van normalitzar mitjançant el mètode Seurat SCTransform v2,84 incloent-hi totes les 7418 característiques detectades, i es van eliminar les diferències entre participants. Totes les metadades rellevants es poden trobar al conjunt de dades suplementari 28.