Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat. Per obtenir els millors resultats, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del vostre navegador (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per assegurar el suport continuat, mostrem el lloc sense dissenyar ni JavaScript.
El creixement microbià de les ferides sovint es manifesta com a biofilms, que interfereixen amb la curació i són difícils d’eradicar. Els nous apòsits de plata afirmen combatre les infeccions de ferides, però els seus efectes de curació independents de la infecció i els seus efectes de curació independents de la infecció són generalment desconeguts. Utilitzant models de biofilm in vitro i in vivo de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, informem de l'efectivitat dels apòsits que generen Ag1+ ions; Ag1+ apòsits que contenen àcid etilenediaminetetraacètic i clorur de benzetoni (Ag1+/EDTA/BC) i apòsits que contenen nitrat de plata (Ag Oxysalts). , que produeixen ions Ag1+, Ag2+ i Ag3+ per combatre el biofilm de ferides i el seu efecte sobre la curació. Els apòsits Ag1+ van tenir efectes mínims sobre el biofilm de ferides in vitro i en els ratolins (C57BL/6J). En canvi, les sals AG oxigenades i els apòsits Ag1+/EDTA/BC van reduir significativament el nombre de bacteris viables en biofilms in vitro i van demostrar una reducció significativa dels components bacterians i EPS en els biofilms de ferides de ratolí. Aquests apòsits van tenir diferents efectes en la curació de ferides infectades per biofilm i no infectades amb biofilm, amb apòsits de sal oxigenats amb efectes més beneficiosos sobre la reepitelialització, la mida de la ferida i la inflamació en comparació amb els tractaments de control i altres apòsits de plata. Les diferents propietats fisicoquímiques dels apòsits de plata poden tenir efectes diferents sobre el biofilm i la curació de ferides, i això s’ha de tenir en compte a l’hora de seleccionar un apòsit per al tractament de ferides infectades per biofilm.
Les ferides cròniques es defineixen com a "ferides que no aconsegueixen progressar a través de les etapes normals de curació de manera ordenada i oportuna" 1. Les ferides cròniques creen una càrrega psicològica, social i econòmica per als pacients i el sistema sanitari. La despesa anual del NHS en el tractament de ferides i les comorbiditats associades s’estima en 8.300 milions de lliures lliures el 2017–182. Les ferides cròniques també són actualment un problema urgent als Estats Units, i Medicare estima el cost anual del tractament dels pacients amb ferides de 28,1 a 96.800 milions de dòlars.
La infecció és un factor important que impedeix la curació de ferides. Les infeccions sovint es manifesten com a biofilms, que estan presents en el 78% de les ferides cròniques no curades. Els biofilms es formen quan els microorganismes s’uneixen irreversiblement a superfícies, com ara superfícies de ferides, i poden agregar-se per formar comunitats productores de polímer extracel·lular (EPS). El biofilm de ferides està associat a una resposta inflamatòria augmentada que comporta danys del teixit, que pot retardar o prevenir la curació4. L’augment del dany dels teixits pot ser degut en part a l’augment de l’activitat de les metaloproteinases de la matriu, la col·lagenasa, l’elastasa i les espècies reactives d’oxigen5. A més, les cèl·lules inflamatòries i els biofilms són ells mateixos consumidors alts d’oxigen i, per tant, poden causar hipòxia local del teixit, esgotant cèl·lules de l’oxigen vital necessaris per a una reparació efectiva del teixit6.
Els biofilms madurs són altament resistents als agents antimicrobians, que requereixen estratègies agressives per controlar les infeccions de biofilm, com el tractament mecànic seguit d’un tractament antimicrobian efectiu. Com que els biofilms es poden regenerar ràpidament, els antimicrobians efectius poden reduir el risc de re-formació després del desbridament quirúrgic7.
La plata s’utilitza cada cop més en apòsits antimicrobians i s’utilitza sovint com a tractament de primera línia per a ferides infectades cròniques. Hi ha molts apòsits de plata disponibles comercialment, cadascun dels quals conté una composició, concentració i matriu de base de plata diferents. Els avenços en armes de plata han provocat el desenvolupament de noves armes de plata. La forma metàl·lica de plata (Ag0) és inerta; Per aconseguir efectivitat antimicrobiana, ha de perdre un electró per formar plata iònica (Ag1+). Els apòsits tradicionals de plata contenen compostos de plata o plata metàl·lica que, quan s’exposen a líquid, es descomponen per formar ions Ag1+. Aquests ions Ag1+ reaccionen amb la cèl·lula bacteriana, eliminant electrons dels components estructurals o processos crítics necessaris per a la supervivència. La tecnologia patentada ha provocat el desenvolupament d’un nou compost de plata, Ag Oxysalts (Nitrat de plata, Ag7NO11), inclòs en els apòsits de ferides. A diferència de la plata tradicional, la descomposició de sals que contenen oxigen produeix estats de plata amb valència més alta (Ag1+, Ag2+i Ag3+). Estudis in vitro han demostrat que les baixes concentracions de sals de plata oxigenades són més efectives que la plata iònica única (AG1+) contra bacteris patògens com Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Escherichia coli8,9. Un altre nou tipus de guarniment de plata inclou ingredients addicionals, és a dir, àcid etilenediaminetetraacètic (EDTA) i clorur de benzetoni (BC), que es diu que s’adrecen a l’EPS de biofilm i augmenten així la penetració de la plata en el biofilm. Aquestes noves tecnologies de plata ofereixen noves maneres d’orientar els biofilms de ferides. Tanmateix, l’impacte d’aquests antimicrobians en l’entorn de la ferida i la curació independent de la infecció és important per assegurar-se que no creen un entorn de ferides desfavorable ni retarden la curació. S'han reportat preocupacions sobre la citotoxicitat de plata in vitro amb diversos apòsits de plata10.11. Tanmateix, la citotoxicitat in vitro encara no s’ha traduït en toxicitat in vivo, i diversos apòsits Ag1+ han demostrat un bon perfil de seguretat12.
Aquí, es va investigar l'efectivitat dels apòsits carboximetilcel·lulosa que contenien noves formulacions de plata contra el biofilm de ferides in vitro i in vivo. A més, es van avaluar els efectes d’aquests apòsits sobre les respostes immunes i la curació independent de la infecció.
Tots els apòsits utilitzats estaven disponibles comercialment. El vestit de fibra de gel de 3 m de Kerracel (3M, Knutsford, Regne Unit) és un vestit de fibra de gel de carboimetilcel·lulosa (CMC) no antimicrobian 100% que es va utilitzar com a vestit de control en aquest estudi. Es van avaluar tres apòsits antimicrobians de plata CMC, és a dir, el vestit de 3M Kerracel AG (3M, Knutsford, Regne Unit), que conté un 1,7%en pes. sal de plata oxigenada (Ag7no11) en ions de plata de valència superior (Ag1+, Ag2+i Ag3+). Durant la descomposició dels ions Ag7no11, Ag1+, Ag2+ i Ag3+ es formen en una proporció d’1: 2: 4. AQUACEL AG EXTRAMENT EXTRADA que conté un 1,2% de clorur de plata (AG1+) (Convatec, Deeside, Regne Unit) 13 i Aquacel AG+apassionat addicional que conté 1,2% de clorur de plata (AG1+), EDTA i clorur de benzetoni (Convatec, Deeside, Regne Unit) 14.
Les soques utilitzades en aquest estudi van ser Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) i Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Els bacteris es van cultivar durant la nit al brou de Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Regne Unit). El cultiu durant la nit es va diluir 1: 100 en el brou de Mueller-Hinton i 200 µl es va xapar a les membranes de ciclopor de 0,2 µm estèrils (Whatman Plc, Maidstone, Regne Unit) a les plaques d'agar de Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Bretanya a Gran Bretanya )). ) Formació de biofilm colonial a 37 ° C durant 24 hores. Aquests biofilms colonials es van provar de contracció logarítmica.
Talleu el guarniment en trossos quadrats de 3 cm2 i pre-misten amb aigua desionitzada estèril. Col·loqueu l’embenat sobre el biofilm de la colònia a la placa d’agar. Es van eliminar cada 24 ha de biofilm i es van quantificar bacteris viables dins del biofilm (CFU/ml) mitjançant dilució en sèrie (10-1 a 10-7) en el brou de neutralització de l'angle de dia (Merck-Millipore). Després de 24 hores d’incubació a 37 ° C, es van realitzar recomptes de plaques estàndard en plaques d’agar Mueller-Hinton. Cada tractament i punt de temps es van realitzar per triplicat i es van repetir recomptes de plaques per a cada dilució.
La pell del ventre de porc s’obté de porcs blancs grans femenins als 15 minuts de la matança d’acord amb els estàndards d’exportació de la Unió Europea. La pell es va afaitar i es va netejar amb tovalloletes d’alcohol, després es va congelar a -80 ° C durant 24 hores per desviar la pell. Després del descongelació, es van rentar 1 cm2 peces de pell tres vegades amb PBS, un 0,6% hipoclorit de sodi i un 70% etanol durant 20 minuts cada vegada. Abans d’eliminar l’epidermis, traieu l’etanol restant rentant 3 vegades en PBS estèril. La pell es va cultivar en una placa de 6 pous amb una membrana de niló de 0,45 μm de gruix (Merck-Millipore) a la part superior i 3 pastilles absorbents (Merck-Millipore) que conté 3 ml de sèrum boví fetal (Sigma) complementats amb un 10% de Dulbecco modificat per Dulbecco EAGLE. Mitjà (medi d'àguila modificat de Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Els biofilms colonials es van cultivar tal com es descriu als estudis d’exposició al biofilm. Després de conrear el biofilm a la membrana durant 72 hores, el biofilm es va aplicar a la superfície de la pell mitjançant un bucle d'inoculació estèril i es va eliminar la membrana. A continuació, es va incubar el biofilm a la dermis del porc durant 24 hores addicionals a 37 ° C per permetre que el biofilm madurés i s’adhereixi a la pell del porc. Després que el biofilm s’hagués madurat i enganxat, es va aplicar un apòsit d’1,5 cm2, pre-mistós amb aigua destil·lada estèril, es va aplicar directament a la superfície de la pell i es va incubar a 37 ° C durant 24 hores. Els bacteris viables es van visualitzar mitjançant la tinció aplicant uniformement el reactiu de viabilitat de les cèl·lules de prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Regne Unit) a la superfície apical de cada explosió i incubant -lo durant 5 minuts. Utilitzeu la càmera digital Leica DFC425 per capturar instantàniament imatges al microscopi Leica MZ8. Les àrees de color rosa es van quantificar mitjançant Image Pro Software Version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). La microscòpia electrònica d’escaneig es va realitzar tal com es descriu a continuació.
Els bacteris cultivats durant la nit es van diluir 1: 100 en brou de Mueller-Hinton. Es van afegir 200 µl de cultiu a la membrana de ciclope de 0,2 μm de 0,2 μm de 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Regne Unit) i es va xapar a l’agar Mueller-Hinton. Les plaques de biofilm es van incubar a 37 ° C durant 72 hores per permetre la formació de biofilm madura.
Després de 3 dies de maduració de biofilm, es va col·locar un embenat quadrat de 3 cm2 directament al biofilm i es va incubar a 37 ° C durant 24 hores. Després d’eliminar l’embenat de la superfície de biofilm, es va afegir 1 ml de reactiu de viabilitat de les cèl·lules de prestoblosa (Invitrogen, Waltham, MA) a la superfície de cada biofilm durant 20 segons. Les superfícies es van assecar abans que es registressin canvis de color mitjançant una càmera digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Regne Unit).
Prepareu els cultius durant la nit a l’agar de Mueller-Hinton, transferiu les colònies individuals a 10 ml de brou Mueller-Hinton i incubeu-lo en un agitador a 37 ° C (100 rpm). Després de la incubació durant la nit, el cultiu es va diluir 1: 100 en el brou de Mueller-Hinton i 300 µl es van detectar a 0,2 µm circular de la membrana ciclopor de Whatman (Whatman International, Maidstone, Regne Unit) en agar de Mueller-Hinton i es va incubar a 37 ° C en 72 hores . . El biofilm madur es va aplicar a la ferida tal com es descriu a continuació.
Tots els treballs amb Animals es van dur a terme a la Universitat de Manchester sota una llicència de projecte aprovada per l’Oficina de Benestar Animal i Revisió ètica (P8721BD27) i d’acord amb les directrius publicades per l’Oficina de la llar sota l’ASPA revisada del 2012. Tots els autors es van adherir a les directrius d’arribada. Els ratolins C57BL/6J de vuit setmanes (Envigo, Oxon, Regne Unit) es van utilitzar per a tots els estudis in vivo. Els ratolins van ser anestesiats amb isoflurane (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Regne Unit) i les seves superfícies dorsals es van afaitar i netejar. A cada ratolí se li va donar una ferida excisional de 2 × 6 mm mitjançant un punxó de biòpsia Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Regne Unit). Per a ferides infectades per biofilm, apliqueu biofilm colonial de 72 hores cultivat a la membrana tal com es descriu anteriorment a la capa dèrmica de la ferida mitjançant un bucle d'inoculació estèril immediatament després de lesions i descartar la membrana. Un centímetre quadrat de vestir està pre-mistós amb aigua estèril per mantenir un entorn de ferida humida. Els apòsits es van aplicar directament a cada ferida i es van cobrir amb pel·lícula de tegaderm 3M (3M, Bracknell, Regne Unit) i adhesiu líquid de mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicats al voltant de les vores per proporcionar adhesió addicional. La buprenorfina (Animalcare, York, Regne Unit) es va administrar a una concentració de 0,1 mg/kg com a analgèsic. Cull ratolins tres dies després de lesions mitjançant el mètode de la llista 1 i traieu -la, a la meitat i emmagatzemeu la zona de la ferida segons sigui necessari.
Es va realitzar una tinció d’hematoxilina (Thermofisher Scientific) i Eosin (Thermofisher Scientific) segons el protocol del fabricant. L’àrea de ferides i la reepitelialització es van quantificar mitjançant Image Pro Software Version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Les seccions de teixit es van desembarcar en xileno (Thermofisher Scientific, Loughborough, Regne Unit), es van rehidratar amb etanol classificat al 100-50% i es van immersar breument en aigua desionitzada (Thermofisher Scientific). La immunohistoquímica es va realitzar mitjançant el kit Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) segons el protocol del fabricant. Els anticossos primaris als neutròfils NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) i macròfags MS CD107B pur M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Regne Unit) es van diluir 1: 100 en solució de bloqueig i afegit a la superfície tallada, seguida de 2 anticossos anti-vectastainstain Kit de substrat ABC i vector de Nova peroxidasa vermella (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i es va contrarestar amb hematoxilina. Les imatges es van adquirir mitjançant un microscopi Olympus BX43 i una càmera digital Olympus DP73 (Olympus, Southend-On-Sea, Regne Unit).
Les mostres de pell es van fixar en un 2,5% de glutaraldehid i un 4% de formaldehid en 0,1 m HEPES (pH 7,4) durant 24 hores a 4 ° C. Les mostres es van deshidratar mitjançant etanol classificat i es van assecar en CO2 mitjançant un assecador de punts crítics de Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Regne Unit) i Sputter recobert amb aliatge de palladi d'or mitjançant un sistema de descàrrega de quòrum SC7620 Mini Sputterer/Glow. Es van imaginar exemplars mitjançant un microscopi electrònic d’escaneig FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) per visualitzar el punt central de la ferida.
El iodur de TOTO-1 (2 μM) es va aplicar a la superfície de la ferida del ratolí excisada i es va incubar durant 5 min a 37 ° C (Thermofisher Scientific) i es va tractar amb SYTO-60 (10 μM) a 37 ° C (Thermofisher Scientific). Les imatges de pila Z de 15 minuts es van crear mitjançant un Leica TCS SP8.
Les dades de rèpliques biològiques i tècniques es van tabular i analitzar mitjançant el programari GraphPad Prism V9 (Software GraphPad, La Jolla, CA). L’anàlisi unidireccional de la variància amb les comparacions múltiples mitjançant la prova post hoc de Dunnett es va utilitzar per provar diferències entre cada tractament i el vestit de control no antimicrobià. Es va considerar significatiu un valor p <0,05.
L’efectivitat dels apòsits fibrosos en gel de plata es va avaluar per primera vegada contra les colònies de biofilm d’estafilococ aureus i Pseudomonas aeruginosa in vitro. Els apòsits de plata contenen diferents fórmules de plata: els apòsits tradicionals de plata produeixen ions Ag1+; Els apòsits de plata, que poden produir ions Ag1+ després de l’addició d’EDTA/BC, poden destruir la matriu de biofilm i exposar els bacteris a la plata sota l’efecte antibacterià de la plata. ions15 i apòsits que contenen sals Ag oxigenades que produeixen ions Ag1+, Ag2+ i Ag3+. La seva efectivitat es va comparar amb un apòsit de control no antimicrobià elaborat amb fibres gelificades. Es van avaluar els bacteris viables restants dins del biofilm cada 24 hores durant 8 dies (figura 1). El dia 5, el biofilm es va reinocular amb 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus o 1,22 × 105p. aeruginosa per avaluar la recuperació de biofilm. En comparació amb els apòsits de control no antimicrobians, els apòsits Ag1+ van tenir un efecte mínim sobre la viabilitat bacteriana a Staphylococcus aureus i els biofilms de Pseudomonas aeruginosa al llarg de 5 dies. En canvi, els apòsits que contenien les sals AG i Ag1 + + EDTA/BC van ser efectius per matar bacteris dins del biofilm en un termini de 5 dies. Després de la inoculació repetida amb bacteris planctònics el dia 5, no es va observar cap restauració del biofilm (Fig. 1).
Quantificació de bacteris viables a Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa biofilms després del tractament amb apòsits de plata. Les colònies de biofilm de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa van ser tractades amb apòsits de plata o apòsits de control no antimicrobians i es va determinar el nombre de bacteris viables cada 24 hores. Després de 5 dies, el biofilm es va reinocular amb 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus o 1,22 × 105p. Les colònies del bacterioplàncton pseudomonas aeruginosa es van formar individualment per avaluar la recuperació de biofilm. Els gràfics mostren una mitjana +/- Error estàndard.
Per visualitzar l'efecte dels apòsits de plata sobre la viabilitat del biofilm, els apòsits es van aplicar a biofilms madurs cultivats a la pell porcina ex vivo. Al cap de 24 hores, s’elimina l’apassionat i el biofilm està tacat amb un colorant reactiu blau, metabolitzat per bacteris vius a un color rosa. Els biofilms tractats amb apòsits de control eren de color rosa, cosa que indica la presència de bacteris viables dins del biofilm (figura 2A). En canvi, el biofilm tractat amb el vestit Ag Oxysols era principalment blau, cosa que indica que els bacteris restants a la superfície de la pell del porc eren bacteris no inviables (figura 2B). Es va observar una coloració mixta de color blau i rosa en biofilms tractats amb apòsits que contenen Ag1+, que indiquen la presència de bacteris viables i no viables dins del biofilm (figura 2C), mentre que els apòsits EDTA/BC que contenien Ag1+ eren predominantment blaus amb alguns punts rosats. indicant zones no afectades pel vestimenta de plata (figura 2D). La quantificació d’àrees actives (rosats) i inactives (blaves) va demostrar que el pegat de control era del 75% actiu (figura 2E). Els apòsits Ag1 + + EDTA/BC es van realitzar de manera similar als apòsits de sal Ag oxigenats, amb taxes de supervivència del 13% i el 14%, respectivament. El vestit Ag1+ també va reduir la viabilitat bacteriana en un 21%. Aquests biofilms es van observar després mitjançant la microscòpia electrònica d’escaneig (SEM). Després del tractament amb el vestit de control i el guarniment Ag1+, es va observar una capa de Pseudomonas aeruginosa que abastava la pell porcina (figura 2f, h), mentre que després del tractament amb el vestit Ag1+, es van trobar poques cèl·lules bacterianes i es van trobar poques cèl·lules bacterianes a sota. Les fibres de col·lagen es poden considerar com l'estructura del teixit de la pell porcina (figura 2G). Després del tractament amb Ag1 + + EDTA/BC, es van veure plaques bacterianes i plaques de fibra de col·lagen subjacents (figura 2i).
Visualització del biofilm de Pseudomonas aeruginosa després del tractament de vestir de plata. (A-D) La viabilitat bacteriana en els biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivats a la pell porcina es va visualitzar mitjançant la viabilitat de prestoblosa 24 hores després del tractament amb apòsits de plata o apòsits de control no antimicrobians. Els bacteris vius són rosats, els bacteris no viables i la pell del porc blau. (E) Quantificació de biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivats a la pell porcina (punt rosa) amb microscòpia electrònica d’escaneig Image Pro Versió 10 (FI) i tractades amb un apòsit de plata o un vestit de control no antimicrobian durant 24 hores. Barra d’escala SEM = 5 µm. (J - M) Els biofilms colonials van créixer en filtres i es van tacar amb un colorant reactiu de prestoble després de 24 hores d'incubació amb apòsits de plata.
Per determinar si el contacte estret entre els apòsits i els biofilms afectava l'efectivitat dels apòsits, els biofilms colonials col·locats sobre una superfície plana van ser tractats amb els apòsits durant 24 hores i després es van tacar amb colorants reactius. El biofilm no tractat era de color rosa fosc (figura 2J). En contrast amb els biofilms tractats amb apòsits que contenen sals AG oxigenades (figura 2K), els biofilms tractats amb apòsits que contenen Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC mostraven bandes de tinció rosa (figura 2L, M). Aquesta coloració rosa indica la presència de bacteris viables i està associada a la zona de sutura dins del apòsit. Aquestes zones cosides creen espais morts que permeten que els bacteris dins del biofilm sobrevisquin.
Per avaluar l'efectivitat dels apòsits de plata in vivo, es van tractar ferides de ratolins de ratolins infectats amb Biofilms de S. aureus madurs i P. aeruginosa amb apòsits de control no antimicrobians o apòsits de plata. Després de 3 dies de tractament, l’anàlisi d’imatges macroscòpiques va mostrar mides de ferides més petites quan es van tractar amb apòsits de sal oxigenats en comparació amb els apòsits de control no antimicrobians i altres apòsits de plata (figura 3A-H). Per confirmar aquestes observacions, es van collir ferides i es van quantificar la superfície de ferides i es va quantificar la reepitelialització en seccions de teixit tenyit d’hematoxilina i eosina mitjançant la versió 10 del programari Image Pro (figura 3i-L).
L’efecte dels apòsits de plata a la superfície de la ferida i la reepitelialització de les ferides infectades amb biofilms. (A - H) Cèl·lules petites infectades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (A - D) i Staphylococcus aureus (E - H) després de tres dies de tractament amb un vestit de control no antimicrobian Vestit. Imatges macroscòpiques representatives. Ferides de ratolins amb Ag1 + + EDTA/BC. (IL) Infecció representativa de Pseudomonas aeruginosa, seccions histològiques tacades amb hematoxilina i eosina, utilitzada per quantificar la zona de ferides i la regeneració epitelial. Quantificació de la zona de ferides (M, O) i la reepitelialització percentual (N, P) de ferides infectades amb Pseudomonas aeruginosa (M, N) i Staphylococcus aureus (O, P) biofilms (per grup de tractament n = 12). Els gràfics mostren una mitjana +/- Error estàndard. * significa p = <0,05 ** significa p = <0,01; Escala macroscòpica = 2,5 mm, escala histològica = 500 µm.
La quantificació de la zona de la ferida en ferides infectades amb el biofilm de Pseudomonas aeruginosa (figura 3M) va demostrar que les ferides tractades amb Oxysalts Ag tenien una mida mitjana de la ferida de 2,5 mm2, mentre que el vestit de control no antimicrobian És cert. va assolir la importància estadística (Figura 3M). P = 0,423). Les ferides tractades amb Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC no van mostrar cap reducció de la zona de ferides (3,1 mm2 i 3,6 mm2, respectivament). El tractament amb un vestit de sal Ag oxigenat va promoure la reepitelialització en una mesura més gran que el apòsit de control no antimicrobian Figura 3n). . , respectivament).
Es van observar tendències similars a la zona de ferides i a la regeneració epitelial en ferides infectades amb biofilms de S. aureus (figura 3O). Els apòsits que contenen sals de plata oxigenades van reduir la superfície de la ferida (2,0 mm2) en un 23% en comparació amb el control de la vendes no antimicrobianes (2,6 mm2), tot i que aquesta reducció no va ser significativa (P = 0,304) (Fig. 3O). A més, la superfície de la ferida del grup de tractament Ag1+ es va reduir lleugerament (2,4 mm2), mentre que la ferida tractada amb Ag1++ EDTA/BC no va reduir la zona de la ferida (2,9 mm2). Les sals d’oxigen d’AG també van promoure la reapitelialització de les ferides infectades amb el biofilm de S. aureus (31%) en major mesura que els tractats amb apòsits de control no antimicrobians (12%, p = 0,003) (figura 3p). El vestit Ag1+ (16%, P = 0,903) i Ag+ 1+ EDTA/BC (14%, p = 0,965) van mostrar nivells de regeneració epitelial similar al control.
Per visualitzar l'efecte dels apòsits de plata sobre la matriu de biofilm, es va realitzar una tinció de iodur de TOTO 1 i SYTO 60 (Fig. 4). Toto 1 iodur és un colorant imprescindible cel·lular que es pot utilitzar per visualitzar amb precisió els àcids nucleics extracel·lulars, abundants en els EPS dels biofilms. SYTO 60 és un colorant permeable a la cèl·lula utilitzat com a contraaguts16. Observacions de TOTO 1 i SYTO 60 iodur en ferides inoculades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (figura 4a-d) i Staphylococcus aureus (figura 4i-L) van demostrar que després de 3 dies de tractament de vestir, els EPS al biofilm es van reduir significativament. que conté sals oxigenades AG i Ag1 + + EDTA/BC. Els apòsits Ag1+ sense components addicionals d’antibiofilm van reduir significativament l’ADN lliure de cèl·lules en ferides inoculades amb Pseudomonas aeruginosa, però eren menys efectius en ferides inoculades amb Staphylococcus aureus.
Imatge in vivo de biofilm de ferides després de 3 dies de tractament amb control de control o plata. Imatges confocals de Pseudomonas aeruginosa (A - D) i Staphylococcus aureus (I - L) tenyits amb TOTO 1 (verd) per visualitzar els àcids nucleics extracel·lulars, un component dels polímers extracel·lulars de biofilm. Per tacar àcids nucleics intracel·lulars, utilitzeu SYTO 60 (vermell). àcids. P. Microscòpia electrònica d’escaneig de ferides infectades amb Pseudomonas aeruginosa (E - H) i Staphylococcus aureus (M - P) Biofilms després de 3 dies de tractament amb control de control i plata. Barra d’escala SEM = 5 µm. Barra d’escala d’imatge confocal = 50 µm.
La microscòpia electrònica d’escaneig va demostrar que els ratolins inoculats amb colònies de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (figura 4E-H) i Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) tenien significativament menys bacteris en les seves ferides després de 3 dies de tractament amb tots els vestits de plata.
Per avaluar l'efecte dels apòsits de plata sobre la inflamació de les ferides en ratolins infectats amb biofilm, les seccions de ferides infectades per biofilm tractades amb control de control o plata durant 3 dies van ser tacades immunohistoquímicament mitjançant anticossos específics per a neutròfils i macròfags. Determinació quantitativa de neutròfils i macròfags internament. Teixit de granulació. Figura 5). Tots els apòsits de plata van reduir el nombre de neutròfils i macròfags en ferides infectades amb Pseudomonas aeruginosa en comparació amb els apòsits de control no antimicrobians després de tres dies de tractament. Tot i això, el tractament amb el vestit de sal de plata oxigenat va donar lloc a una reducció més gran dels neutròfils (P = <0,0001) i macròfags (P = <0,0001) en comparació amb altres apòsits de plata provats (figura 5i, j). Tot i que Ag1++ EDTA/BC va tenir un efecte més gran en el biofilm de la ferida, va reduir els nivells de neutròfils i macròfags en menor mesura que el apòsit Ag1+. També es van observar ferides moderades infectades amb biofilm de S. aureus després de vestir -se amb Ag (P = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) i Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) oxisols en comparació amb el control. S’observen tendències similars per a la neutropènia. embenat (Fig. 5K). Tot i això, només el vestit de sal Ag oxigenat va mostrar una reducció significativa del nombre de macròfags del teixit de granulació en comparació amb el control de les ferides infectades amb biofilms de S. aureus (p = 0,0339) (figura 5L).
Els neutròfils i els macròfags es van quantificar en ferides infectades amb Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus biofilms després de 3 dies de tractament amb control no antimicrobià o apòsits de plata. Els neutròfils (AD) i els macròfags (EH) es van quantificar en seccions de teixit tacades amb anticossos específics per a neutròfils o macròfags. Quantificació de neutròfils (I i K) i macròfags (J i L) en ferides infectades amb Pseudomonas aeruginosa (I i J) i Staphylococcus aureus (K&L) biofilms. N = 12 per grup. Els gràfics mostren una mitjana de +/- Error estàndard, valors de significació en comparació amb el vestit de control no antibacterià, * significa p = <0,05, ** significa p = <0,01; *** significa p = <0,001; indica p = <0,0001).
A continuació, es va valorar l'efecte dels apòsits de plata sobre la curació independent de la infecció. Les ferides excisionals no infectades van ser tractades amb un apòsit de control no antimicrobià o un apòsit de plata durant 3 dies (figura 6). Entre els apòsits de plata provats, només les ferides tractades amb el vestit de sal oxigenat apareixien més petites en imatges macroscòpiques que les ferides tractades amb el control (figura 6a-d). La quantificació de la superfície de la ferida mitjançant anàlisi histològica va demostrar que la superfície mitjana de la ferida després del tractament amb el vestit de Ag Oxysols va ser de 2,35 mm2 en comparació amb 2,96 mm2 per a ferides tractades amb el grup de control, però aquesta diferència no va assolir significació estadística (p = 0,488) (Fig . En canvi, no es va observar cap reducció de la zona de ferides després del tractament amb apòsits Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) ni Ag1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) en comparació amb el grup de control. Es va observar un augment de la regeneració epitelial amb el vestit Ag Oxysol en comparació amb el grup de control (30% vs 22%, respectivament), tot i que això no va assolir la importància (p = 0,067), això és força significatiu i confirma resultats anteriors. Un apòsit amb oxysols promou la reepitelialització. -Epitelització de ferides no infectades17. En canvi, el tractament amb els apòsits Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC no va tenir cap efecte ni va mostrar una disminució de la reepitelialització en comparació amb el control.
Efecte del vestit de ferides de plata sobre la curació de ferides en ratolins no infectats amb una resecció completa. (AD) Imatges macroscòpiques representatives de ferides després de tres dies de tractament amb un apòsit de control no antimicrobià i un apòsit de plata. (EH) Seccions de ferides representatives tacades amb hematoxilina i eosina. La quantificació de la superfície de les ferides (I) i el percentatge de reepitelialització (J) es van calcular a partir de seccions histològiques al punt mig de la ferida mitjançant el programari d’anàlisi d’imatges (n = 11–12 per grup de tractament). Els gràfics mostren una mitjana +/- Error estàndard. * significa P = <0,05.
La plata té una llarga història d’ús com a teràpia antimicrobiana en la curació de ferides, però les diverses formulacions i mètodes de lliurament poden donar lloc a diferències en l’eficàcia antimicrobiana 18. A més, les propietats antibiofilm dels sistemes específics de lliurament de plata no s’entenen del tot. Tot i que la resposta immune de l’hoste és relativament eficaç contra els bacteris planctònics, generalment és menys eficaç contra els biofilms19. Els bacteris planctònics són fàcilment fagocitosos pels macròfags, però dins dels biofilms, les cèl·lules agregades plantegen problemes addicionals limitant la resposta de l’hoste fins al punt que les cèl·lules immunes poden patir apoptosi i alliberar factors proinflamatoris per millorar la resposta immune20. S’ha observat que alguns leucòcits poden penetrar en biofilms21 però no poden fer bacteris fagocitoses un cop compromesa aquesta defensa22. S’hauria d’utilitzar un enfocament holístic per donar suport a la resposta immune de l’hoste contra la infecció de biofilm de ferides. El desbridament de les ferides pot alterar físicament el biofilm i eliminar la major part del bioburden, però la resposta immune de l'amfitrió pot ser ineficaç contra el biofilm restant, sobretot si la resposta immune de l'amfitrió està compromesa. Així, les teràpies antimicrobianes com els apòsits de plata poden donar suport a la resposta immune de l’hoste i eliminar les infeccions de biofilm. La composició, la concentració, la solubilitat i el substrat de lliurament poden influir en l'efectivitat antimicrobiana de la plata. En els darrers anys, els avenços en la tecnologia de processament de plata han fet que aquests apòsits siguin més efectius9,23. A mesura que avança la tecnologia de vestir de plata, és important comprendre l’efectivitat d’aquests apòsits en el control de la infecció de ferides i, el que és més important, l’impacte d’aquestes potents formes de plata en l’entorn de la ferida i la curació.
En aquest estudi, vam comparar l'efectivitat de dos apòsits avançats de plata amb apòsits convencionals de plata que produeixen ions Ag1+ contra biofilms mitjançant diferents models in vitro i in vivo. També es va valorar l'efecte d'aquests apòsits sobre l'entorn de la ferida i la curació independent de la infecció. Per minimitzar la influència de la matriu de lliurament, tots els apòsits de plata provats estaven compostos per carboximetilcellulosa.
La nostra avaluació preliminar d’aquests apòsits de plata contra biofilms colonials de Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus demostra que, a diferència dels apòsits tradicionals Ag1+, dos apòsits avançats de plata, Ag1++ EDTA/BC i sals Ag oxigenades, són efectius a 5. Matant efectivament bacteris biofilms dins dins de dins Uns dies. A més, aquests apòsits impedeixen la re-formació del biofilm en exposició repetida a bacteris planctònics. El vestit Ag1+ contenia clorur de plata, el mateix compost de plata i matriu base que Ag1++ EDTA/BC, i tenia un efecte limitat sobre la viabilitat bacteriana dins del biofilm durant el mateix període. L'observació que un apòsit Ag1++ EDTA/BC era més eficaç contra el biofilm que un apòsit Ag1+ format per la mateixa matriu i un compost de plata dóna suport a la idea que els ingredients addicionals són necessaris per augmentar l'efectivitat del clorur de plata contra el biofilm, com s'ha informat en altres llocs15. Aquests resultats donen suport a la idea que BC i EDTA tenen un paper addicional que contribueix a l'efectivitat general del vestit i que l'absència d'aquest component en els apòsits Ag1+ pot haver contribuït a la no demostrar l'eficàcia in vitro. Vam trobar que els apòsits de sal Ag oxigenats que produeixen ions Ag2+ i Ag3+ presentaven una eficàcia antibacteriana més forta que Ag1+ i a nivells similars a Ag1++ EDTA/BC. No obstant això, a causa de l’elevat potencial redox, no està clar quant de temps els ions Ag3+ es mantenen actius i efectius contra els biofilms de ferides i, per tant, mereixen un estudi addicional. A més, hi ha molts apòsits diferents que generen ions Ag1+ que no es van provar en aquest estudi. Aquests apòsits estan compostos per diferents compostos de plata, concentracions i matrius de base, que poden influir en el lliurament d’ions Ag1+ i la seva efectivitat contra els biofilms. També convé assenyalar que hi ha molts models diferents in vitro i in vivo utilitzats per avaluar l'efectivitat dels apòsits de ferides contra biofilms. El tipus de model utilitzat, així com el contingut de sal i proteïna dels mitjans utilitzats en aquests models, influiran en l'efectivitat de la vestimenta. En el nostre model in vivo, vam permetre que el biofilm madurés in vitro i després el vam transferir a la superfície dèrmica de la ferida. La resposta immune del ratolí amfitrió és relativament eficaç contra els bacteris planctònics aplicats a la ferida, formant així un biofilm a mesura que la ferida es cura. L’addició de biofilm madur a una ferida limita l’efectivitat de la resposta immune de l’hoste a la formació de biofilm, permetent que el biofilm madur s’estableixi dins de la ferida abans de començar la curació. Així, el nostre model ens permet avaluar l'efectivitat dels apòsits antimicrobians en biofilms madurs abans que les ferides comencin a curar -se.
També vam trobar que l’ajust de vestir va influir en l’efectivitat dels apòsits de plata en biofilms in vitro i pell porcina. El contacte estret amb la ferida es considera crític per a l'efectivitat antimicrobiana de la vestimenta24,25. Els apòsits que contenien sals AG oxigenades estaven en un contacte estret amb biofilms madurs, donant lloc a una reducció significativa del nombre de bacteris viables dins del biofilm després de 24 hores. En canvi, quan es tractava amb apòsits Ag1+ i Ag1++ EDTA/BC, es va mantenir un nombre significatiu de bacteris viables. Aquests apòsits contenen sutures al llarg de tota la longitud del apòsit, cosa que crea espais morts que impedeixen un contacte estret amb el biofilm. En els nostres estudis in vitro, aquestes zones sense contacte van impedir la matança de bacteris viables dins del biofilm. Es va avaluar la viabilitat bacteriana només després de 24 hores de tractament; Amb el pas del temps, a mesura que el vestit es satura, pot haver -hi menys espai mort, reduint la zona d’aquests bacteris viables. Tot i això, això posa de manifest la importància de la composició del vestit, no només el tipus de plata en el guarniment.
Si bé els estudis in vitro són útils per comparar l'efectivitat de diferents tecnologies de plata, també és important comprendre els efectes d'aquests apòsits sobre biofilms in vivo, on el teixit hoste i les respostes immunes contribueixen a l'efectivitat dels apòsits contra els biofilms. L’efecte d’aquests apòsits sobre els biofilms de ferides es va observar mitjançant la microscòpia electrònica d’escaneig i la tinció EPS del biofilm mitjançant colorants d’ADN intracel·lulars i extracel·lulars. Vam trobar que després de 3 dies de tractament, tots els apòsits eren efectius per reduir l’ADN lliure de cèl·lules en ferides infectades per biofilm, però el vestit Ag1+ era menys eficaç en les ferides infectades per Staphylococcus aureus. La microscòpia electrònica d’escaneig també va demostrar que els bacteris significativament menys estaven presents en ferides tractades amb els apòsits de plata, tot i que això va ser més pronunciat amb el vestit de sal Ag oxigenat i el vestit Ag1++ EDTA/BC en comparació amb el vestit Ag1+. Aquestes dades mostren que els apòsits de plata provats tenien diferents graus d’impacte en l’estructura de biofilm, però cap dels apòsits de plata va poder eradicar el biofilm, donant suport a la necessitat d’un enfocament holístic per al tractament de les infeccions de biofilm de ferides; Ús de braços de plata. El tractament va precedit de desbridament físic per eliminar la major part del biofilm.
Les ferides cròniques sovint es troben en un estat d’inflamació greu, amb l’excés de cèl·lules inflamatòries al teixit de la ferida durant un període prolongat de temps, provocant danys del teixit i esgotant l’oxigen necessari per al metabolisme eficient i la funció en la ferida26. Els biofilms agreugen aquest entorn de ferides hostils afectant negativament la curació de diverses maneres, incloent la inhibició de la proliferació cel·lular i la migració i l’activació de citocines proinflamatòries27. A mesura que els apòsits de plata es fan més efectius, és important comprendre l’impacte que tenen en l’entorn de la ferida i la curació.
Curiosament, tot i que tots els apòsits de plata van afectar la composició de biofilm, només els apòsits de sal de plata oxigenats van augmentar la reepitelialització d’aquestes ferides infectades. Aquestes dades donen suport a les nostres troballes anteriors17 i les de Kalan et al. (2017) 28, que va demostrar una bona seguretat i perfils de toxicitat de sals de plata oxigenades, ja que les concentracions més baixes de plata eren efectives contra els biofilms.
El nostre estudi actual posa de manifest les diferències en la tecnologia de plata entre els apòsits antimicrobians de plata i l’impacte d’aquesta tecnologia en l’entorn de la ferida i la curació independent de la infecció. Tot i això, aquests resultats difereixen dels estudis anteriors que demostren que el vestit Ag1 + + EDTA/BC va millorar els paràmetres de curació de les orelles de conill ferides in vivo. Tot i això, això pot ser degut a diferències en models animals, temps de mesura i mètodes d'aplicació bacteriana29. En aquest cas, les mesures de ferides es van prendre 12 dies després de lesions per permetre que els ingredients actius de la apòsit actuessin sobre el biofilm durant un període de temps més llarg. Això es recolza en un estudi que demostra que les úlceres de cames infectades clínicament tractades amb Ag1 + + EDTA/BC van augmentar inicialment de mida després d’una setmana de tractament, i després durant les properes 3 setmanes de tractament amb Ag1 + + EDTA/BC i en les 4 setmanes de les setmanes de les Ús de no antimicrobians. drogues. Apòsits CMC per reduir la mida de les úlceres30.
S'han demostrat que algunes formes i concentracions de plata són citotòxiques in vitro 11, però aquests resultats in vitro no sempre es tradueixen en efectes adversos in vivo. A més, els avenços en tecnologia de plata i una millor comprensió dels compostos i les concentracions de plata en els apòsits han provocat el desenvolupament de molts apòsits de plata segurs i efectius. No obstant això, a mesura que avança la tecnologia de vestir de plata, és important comprendre l'impacte d'aquests apòsits en el medi ambient de la ferida31,32,33. Anteriorment es va informar que la taxa de reapitelialització augmentada correspon a una proporció més gran de macròfags antiinflamatoris M2 en comparació amb el fenotip M1 proinflamatori. Això es va notar en un model anterior de ratolí on es van comparar els apòsits de ferides d’hidrogel de plata amb la sulfadiazina de plata i els hidrogels no antimicrobians34.
Les ferides cròniques poden presentar inflamacions excessives i s’ha observat que la presència d’excés de neutròfils pot ser perjudicial per a la curació de ferides35. En un estudi en ratolins esgotats amb neutròfils, la presència de neutròfils va retardar la reepitelialització. La presència d’excés de neutròfils condueix a nivells elevats de proteases i espècies d’oxigen reactives, com el superòxid i el peròxid d’hidrogen, que s’associen a ferides cròniques i de curació lenta37,38. De la mateixa manera, un augment del nombre de macròfags, si no es controla, pot provocar una curació de ferides retardada39. Aquest augment és particularment important si els macròfags no poden passar d’un fenotip proinflamatori a un fenotip de curació pro, donant com a resultat que les ferides no surtin de la fase inflamatòria de la curació40. Es va observar una disminució dels neutròfils i els macròfags en ferides infectades per biofilm després de 3 dies de tractament amb tots els apòsits de plata, però la disminució va ser més acusada amb els apòsits de sal oxigenats. Aquesta disminució pot ser un resultat directe de la resposta immune a la plata, una resposta a la disminució de Bioburden o la ferida en una fase posterior de curació i, per tant, es redueix les cèl·lules immunes de la ferida. Reduir el nombre de cèl·lules inflamatòries de la ferida pot mantenir un entorn propici per a la curació de ferides. El mecanisme d’acció de com els Oxysalts Ag promouen la curació independent de la infecció no està clar, però la capacitat dels Oxysalts Ag de produir oxigen i destruir nivells nocius de peròxid d’hidrogen, un mediador de la inflamació, pot explicar-ho i requereix més estudis17.
Les ferides infectades per no curar cròniques representen un problema tant per a metges com per a pacients. Tot i que molts apòsits afirmen que l'efectivitat antimicrobiana, la investigació rarament se centra en altres factors clau que influeixen en el microambient de la ferida. Aquest estudi demostra que diferents tecnologies de plata tenen una eficàcia antimicrobiana diferent i, importantment, diferents efectes sobre l’entorn de la ferida i la curació, independentment de la infecció. Tot i que aquests estudis in vitro i in vivo mostren l'efectivitat d'aquests apòsits en el tractament de les infeccions de ferides i la promoció de la curació, es necessiten assajos controlats aleatoritzats per avaluar l'efectivitat d'aquests apòsits a la clínica.
Els conjunts de dades utilitzats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.
Posada a la hora: 15-2024 de juliol