Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per obtenir els millors resultats, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del vostre navegador (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
El creixement microbià en ferides sovint es manifesta com a biofilms, que interfereixen amb la curació i són difícils d'eradicar. Els nous apòsits de plata afirmen combatre les infeccions de ferides, però la seva eficàcia antibiofilm i els efectes curatius independents de la infecció són generalment desconeguts. Utilitzant models de biofilm in vitro i in vivo de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, informem de l'eficàcia dels apòsits generadors d'ions Ag1+; apòsits Ag1+ que contenen àcid etilendiaminotetraacètic i clorur de benzetoni (Ag1+/EDTA/BC), i apòsits que contenen nitrat de plata (oxisals d'Ag), que produeixen ions Ag1+, Ag2+ i Ag3+ per combatre el biofilm de la ferida i el seu efecte sobre la curació. Els apòsits Ag1+ van tenir efectes mínims sobre el biofilm de la ferida in vitro i en ratolins (C57BL/6j). En canvi, les sals d'Ag oxigenades i els apòsits Ag1+/EDTA/BC van reduir significativament el nombre de bacteris viables en biofilms in vitro i van demostrar una reducció significativa dels components bacterians i EPS en biofilms de ferides de ratolí. Aquests apòsits van tenir efectes diferents en la curació de les ferides infectades per biofilm i no infectades per biofilm, i els apòsits de sal oxigenada van tenir efectes més beneficiosos sobre la reepitelització, la mida de la ferida i la inflamació en comparació amb els tractaments de control i altres apòsits de plata. Les diferents propietats fisicoquímiques dels apòsits de plata poden tenir efectes diferents sobre el biofilm de la ferida i la curació, i això s'ha de tenir en compte a l'hora de seleccionar un apòsit per al tractament de ferides infectades per biofilm.
Les ferides cròniques es defineixen com a "ferides que no aconsegueixen progressar a través de les etapes normals de curació de manera ordenada i oportuna"1. Les ferides cròniques creen una càrrega psicològica, social i econòmica per als pacients i el sistema sanitari. La despesa anual del NHS en el tractament de ferides i comorbiditats associades s'estima en 8.300 milions de lliures esterlines el 2017-182. Les ferides cròniques també són actualment un problema urgent als Estats Units, i Medicare estima el cost anual del tractament de pacients amb ferides entre 28.100 i 96.800 milions de dòlars3.
La infecció és un factor important que impedeix la cicatrització de les ferides. Les infeccions sovint es manifesten com a biofilms, que són presents en el 78% de les ferides cròniques que no cicatritzen. Els biofilms es formen quan els microorganismes s'adhereixen irreversiblement a superfícies, com ara les superfícies de les ferides, i poden agregar-se per formar comunitats productores de polímers extracel·lulars (EPS). El biofilm de la ferida s'associa amb un augment de la resposta inflamatòria que provoca danys als teixits, que poden retardar o impedir la cicatrització4. L'augment del dany als teixits pot ser degut en part a l'augment de l'activitat de les metal·loproteinases de la matriu, la col·lagenasa, l'elastasa i les espècies reactives d'oxigen5. A més, les cèl·lules inflamatòries i els biofilms són ells mateixos grans consumidors d'oxigen i, per tant, poden causar hipòxia tissular local, cosa que esgota les cèl·lules de l'oxigen vital necessari per a una reparació tissular eficaç6.
Els biofilms madurs són altament resistents als agents antimicrobians, cosa que requereix estratègies agressives per controlar les infeccions per biofilms, com ara el tractament mecànic seguit d'un tractament antimicrobià eficaç. Com que els biofilms es poden regenerar ràpidament, els antimicrobians eficaços poden reduir el risc de reformació després del desbridament quirúrgic7.
La plata s'utilitza cada cop més en apòsits antimicrobians i sovint s'utilitza com a tractament de primera línia per a ferides infectades cròniques. Hi ha molts apòsits de plata disponibles comercialment, cadascun amb una composició, concentració i matriu base de plata diferents. Els avenços en els braçalets de plata han conduït al desenvolupament de nous braçalets de plata. La forma metàl·lica de la plata (Ag0) és inert; per aconseguir una eficàcia antimicrobiana, ha de perdre un electró per formar plata iònica (Ag1+). Els apòsits de plata tradicionals contenen compostos de plata o plata metàl·lica que, quan s'exposen al líquid, es descomponen per formar ions Ag1+. Aquests ions Ag1+ reaccionen amb la cèl·lula bacteriana, eliminant electrons dels components estructurals o processos crítics necessaris per a la supervivència. La tecnologia patentada ha conduït al desenvolupament d'un nou compost de plata, les oxilsals d'Ag (nitrat de plata, Ag7NO11), que s'inclou en els apòsits per a ferides. A diferència de la plata tradicional, la descomposició de les sals que contenen oxigen produeix estats de plata amb una valència més alta (Ag1+, Ag2+ i Ag3+). Estudis in vitro han demostrat que baixes concentracions de sals de plata oxigenades són més efectives que la plata d'un sol ió (Ag1+) contra bacteris patògens com ara Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Escherichia coli8,9. Un altre nou tipus d'apòsit de plata inclou ingredients addicionals, concretament àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA) i clorur de benzetoni (BC), que es diu que actuen sobre el biofilm EPS i, per tant, augmenten la penetració de la plata al biofilm. Aquestes noves tecnologies de la plata ofereixen noves maneres d'abordar els biofilms de les ferides. Tanmateix, l'impacte d'aquests antimicrobians en l'entorn de la ferida i la curació independent de la infecció és important per garantir que no creïn un entorn desfavorable de la ferida ni retardin la curació. S'han reportat preocupacions sobre la citotoxicitat de la plata in vitro amb diversos apòsits de plata10,11. Tanmateix, la citotoxicitat in vitro encara no s'ha traduït en toxicitat in vivo, i diversos apòsits Ag1+ han demostrat un bon perfil de seguretat12.
Aquí, vam investigar l'efectivitat dels apòsits de carboximetilcel·lulosa que contenen noves formulacions de plata contra el biofilm de ferides in vitro i in vivo. A més, es van avaluar els efectes d'aquests apòsits sobre les respostes immunitàries i la curació independentment de la infecció.
Tots els apòsits utilitzats eren disponibles comercialment. L'apòsit de fibra de gel 3M Kerracel (3M, Knutsford, Regne Unit) és un apòsit de fibra de gel 100% carboximetilcel·lulosa (CMC) no antimicrobià que es va utilitzar com a apòsit de control en aquest estudi. Es van avaluar tres apòsits de plata CMC antimicrobians, concretament l'apòsit 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Regne Unit), que conté un 1,7% en pes de sal de plata oxigenada (Ag7NO11) en ions de plata de valència superior (Ag1+, Ag2+ i Ag3+). Durant la descomposició d'Ag7NO11, es formen ions Ag1+, Ag2+ i Ag3+ en una proporció d'1:2:4. Apòsit Aquacel Ag Extra que conté 1,2% de clorur de plata (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Regne Unit) 13 i apòsit Aquacel Ag + Extra que conté 1,2% de clorur de plata (Ag1+), EDTA i clorur de benzetoni (ConvaTec, Deeside, Regne Unit) 14.
Les soques utilitzades en aquest estudi van ser Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) i Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Els bacteris es van cultivar durant la nit en brou de Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Regne Unit). El cultiu durant la nit es va diluir 1:100 en brou de Mueller-Hinton i es van sembrar 200 µl en membranes de ciclopor Whatman estèrils de 0,2 µm (Whatman plc, Maidstone, Regne Unit) en plaques d'agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Bretanya).) Formació de biofilms colonials a 37 °C durant 24 hores. Aquests biofilms colonials es van provar per a la contracció logarítmica.
Talleu l'apòsit en trossos quadrats de 3 cm2 i humitegeu-los prèviament amb aigua desionitzada estèril. Col·loqueu el bena sobre el biofilm de la colònia a la placa d'agar. Es van eliminar cada 24 ha de biofilm i es van quantificar els bacteris viables dins del biofilm (UFC/ml) mitjançant dilució seriada (10−1 a 10−7) en brou de neutralització d'angle diürn (Merck-Millipore). Després de 24 hores d'incubació a 37 °C, es van realitzar recomptes estàndard en plaques d'agar Mueller-Hinton. Cada tractament i punt temporal es va realitzar per triplicat i es van repetir els recomptes en plaques per a cada dilució.
La pell de panxa de porc s'obté de porcs femelles de raça Large White dins dels 15 minuts posteriors al sacrifici, d'acord amb els estàndards d'exportació de la Unió Europea. La pell es va afaitar i netejar amb tovalloletes amb alcohol, i després es va congelar a -80 °C durant 24 hores per desvitalitzar la pell. Després de la descongelació, es van rentar trossos de pell d'1 cm2 tres vegades amb PBS, hipoclorit de sodi al 0,6% i etanol al 70% durant 20 minuts cada vegada. Abans de retirar l'epidermis, elimineu qualsevol residu d'etanol rentant-los 3 vegades amb PBS estèril. La pell es va cultivar en una placa de 6 pous amb una membrana de niló de 0,45 μm de gruix (Merck-Millipore) a la part superior i 3 coixinets absorbents (Merck-Millipore) que contenien 3 ml de sèrum fetal boví (Sigma) suplementat amb un 10% de medi Eagle modificat per Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Els biofilms colonials es van cultivar tal com es descriu per als estudis d'exposició a biofilms. Després de cultivar el biofilm a la membrana durant 72 hores, es va aplicar el biofilm a la superfície de la pell mitjançant una nansa d'inoculació estèril i es va retirar la membrana. A continuació, el biofilm es va incubar a la dermis del porc durant 24 hores més a 37 °C per permetre que el biofilm madurés i s'adherís a la pell del porc. Després que el biofilm hagués madurat i adherit, es va aplicar un apòsit d'1,5 cm2, prèviament humitejat amb aigua destil·lada estèril, directament a la superfície de la pell i es va incubar a 37 °C durant 24 hores. Els bacteris viables es van visualitzar mitjançant tinció aplicant uniformement el reactiu de viabilitat cel·lular PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Regne Unit) a la superfície apical de cada explant i incubant-lo durant 5 minuts. Utilitzeu la càmera digital Leica DFC425 per capturar imatges instantàniament al microscopi Leica MZ8. Les àrees de color rosa es van quantificar mitjançant el programari Image Pro versió 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). La microscòpia electrònica de rastreig es va realitzar tal com es descriu a continuació.
Els bacteris que van créixer durant la nit es van diluir 1:100 en brou de Mueller-Hinton. Es van afegir 200 μl de cultiu a una membrana de ciclopor Whatman estèril de 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Regne Unit) i es van sembrar en agar Mueller-Hinton. Les plaques de biofilm es van incubar a 37 °C durant 72 hores per permetre la formació de biofilm madur.
Després de 3 dies de maduració del biofilm, es va col·locar un embenat quadrat de 3 cm2 directament sobre el biofilm i es va incubar a 37 °C durant 24 hores. Després de retirar l'embenat de la superfície del biofilm, es va afegir 1 ml de reactiu de viabilitat cel·lular PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) a la superfície de cada biofilm durant 20 segons. Les superfícies es van assecar abans de registrar els canvis de color amb una càmera digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Regne Unit).
Prepareu cultius durant la nit en agar Mueller-Hinton, transferiu les colònies individuals a 10 ml de brou Mueller-Hinton i incubeu-les en un agitador a 37 °C (100 rpm). Després de la incubació durant la nit, el cultiu es va diluir 1:100 en brou Mueller-Hinton i es van dipositar 300 µl en una membrana circular de ciclopor Whatman de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Regne Unit) en agar Mueller-Hinton i es va incubar a 37 °C en 72 hores. El biofilm madur es va aplicar a la ferida tal com es descriu a continuació.
Tot el treball amb animals es va dur a terme a la Universitat de Manchester sota una llicència de projecte aprovada per l'Oficina de Benestar Animal i Revisió Ètica (P8721BD27) i d'acord amb les directrius publicades pel Ministeri de l'Interior sota l'ASPA revisada del 2012. Tots els autors van complir les directrius d'arribada. Es van utilitzar ratolins C57BL/6j de vuit setmanes (Envigo, Oxon, Regne Unit) per a tots els estudis in vivo. Els ratolins van ser anestesiats amb isoflurà (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Regne Unit) i se'ls van afaitar i netejar les superfícies dorsals. A cada ratolí se li va fer una ferida excisional de 2 × 6 mm mitjançant un punxó de biòpsia Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Regne Unit). Per a ferides infectades amb biofilm, apliqueu biofilm colonial de 72 hores cultivat a la membrana tal com s'ha descrit anteriorment a la capa dèrmica de la ferida mitjançant un nansa d'inoculació estèril immediatament després de la lesió i descarteu la membrana. Un centímetre quadrat d'apòsit s'humiteja prèviament amb aigua estèril per mantenir un ambient humit a la ferida. Es van aplicar apòsits directament a cada ferida i es van cobrir amb una pel·lícula de 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Regne Unit) i un adhesiu líquid Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicat al voltant de les vores per proporcionar una adhesió addicional. Es va administrar buprenorfina (Animalcare, York, Regne Unit) a una concentració de 0,1 mg/kg com a analgèsic. Es van sacrificar els ratolins tres dies després de la lesió utilitzant el mètode de la Llista 1 i es van retirar, dividir per la meitat i emmagatzemar la zona de la ferida segons calgués.
La tinció amb hematoxilina (ThermoFisher Scientific) i eosina (ThermoFisher Scientific) es va realitzar segons el protocol del fabricant. La zona de la ferida i la reepitelització es van quantificar mitjançant el programari Image Pro versió 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Les seccions de teixit es van desparafinar en xilè (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Regne Unit), es van rehidratar amb etanol graduat al 100-50% i es van submergir breument en aigua desionitzada (ThermoFisher Scientific). La immunohistoquímica es va realitzar utilitzant el kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) segons el protocol del fabricant. Els anticossos primaris contra els neutròfils NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) i els macròfags Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Regne Unit) es van diluir 1:100 en una solució de bloqueig i es van afegir a la superfície del tall, seguits de 2 anticossos anti-, VectaStain ABC i el kit de substrat Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i es van contratenyir amb hematoxilina. Les imatges es van obtenir amb un microscopi Olympus BX43 i una càmera digital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Regne Unit).
Les mostres de pell es van fixar en glutaraldehid al 2,5% i formaldehid al 4% en HEPES 0,1 M (pH 7,4) durant 24 hores a 4 °C. Les mostres es van deshidratar amb etanol graduat i es van assecar en CO2 mitjançant un assecador de punts crítics Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Regne Unit) i es van recobrir per pulverització catòdica amb un aliatge d'or-pal·ladi mitjançant un sistema de mini pulverització catòdica/descàrrega luminescent Quorum SC7620. Les mostres es van obtenir imatges mitjançant un microscopi electrònic de rastreig FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) per visualitzar el punt central de la ferida.
Es va aplicar iodur de Toto-1 (2 μM) a la superfície de la ferida del ratolí excisada i es va incubar durant 5 minuts a 37 °C (ThermoFisher Scientific) i es va tractar amb Syto-60 (10 μM) a 37 °C (ThermoFisher Scientific). Es van crear imatges Z-stack de 15 minuts amb un Leica TCS SP8.
Les dades de rèplica biològiques i tècniques es van tabular i analitzar mitjançant el programari Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Es va utilitzar una anàlisi de la variància unidireccional amb comparacions múltiples mitjançant la prova post hoc de Dunnett per comprovar les diferències entre cada tractament i l'apòsit de control no antimicrobià. Es va considerar significatiu un valor p <0,05.
L'eficàcia dels apòsits fibrosos de gel de plata es va avaluar primer contra colònies de biofilm de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa in vitro. Els apòsits de plata contenen diferents fórmules de plata: els apòsits de plata tradicionals produeixen ions Ag1+; els apòsits de plata, que poden produir ions Ag1+ després de l'addició d'EDTA/BC, poden destruir la matriu del biofilm i exposar els bacteris a la plata sota l'efecte antibacterià de la plata. ions15 i apòsits que contenen sals d'Ag oxigenades que produeixen ions Ag1+, Ag2+ i Ag3+. La seva eficàcia es va comparar amb un apòsit de control no antimicrobià fet de fibres gelificades. Els bacteris viables restants dins del biofilm es van avaluar cada 24 hores durant 8 dies (Figura 1). El dia 5, el biofilm es va reinocular amb 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus o 1,22×105P. aeruginosa per avaluar la recuperació del biofilm. En comparació amb els apòsits de control no antimicrobians, els apòsits Ag1+ van tenir un efecte mínim sobre la viabilitat bacteriana en biofilms de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa durant 5 dies. En canvi, els apòsits que contenien Ag oxigenada i sals d'Ag1+ + EDTA/BC van ser eficaços per matar bacteris dins del biofilm en 5 dies. Després d'inoculació repetida amb bacteris planctònics el dia 5, no es va observar cap restauració del biofilm (Fig. 1).
Quantificació de bacteris viables en biofilms de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa després del tractament amb apòsits de plata. Les colònies de biofilm de Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa es van tractar amb apòsits de plata o apòsits de control no antimicrobians, i el nombre de bacteris viables restants es va determinar cada 24 hores. Després de 5 dies, el biofilm es va tornar a ocular amb 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus o 1,22 × 105P. Es van formar colònies del bacterioplàncton Pseudomonas aeruginosa individualment per avaluar la recuperació del biofilm. Els gràfics mostren la mitjana +/- de l'error estàndard.
Per visualitzar l'efecte dels apòsits de plata sobre la viabilitat del biofilm, es van aplicar apòsits a biofilms madurs cultivats sobre pell porcina ex vivo. Després de 24 hores, es retira l'apòsit i el biofilm es tenyeix amb un colorant blau reactiu, que és metabolitzat pels bacteris vius a un color rosa. Els biofilms tractats amb apòsits de control eren rosats, cosa que indica la presència de bacteris viables dins del biofilm (Figura 2A). En canvi, el biofilm tractat amb l'apòsit d'oxisols d'Ag era principalment blau, cosa que indica que els bacteris restants a la superfície de la pell del porc eren bacteris no viables (Figura 2B). Es va observar una coloració blava i rosa mixta en biofilms tractats amb apòsits que contenien Ag1+, cosa que indica la presència de bacteris viables i no viables dins del biofilm (Figura 2C), mentre que els apòsits d'EDTA/BC que contenien Ag1+ eren predominantment blaus amb algunes taques roses, cosa que indica zones no afectades per l'apòsit de plata (Figura 2D). La quantificació de les zones actives (rosa) i inactives (blava) va mostrar que el pegat de control tenia un 75% d'activitat (Figura 2E). Els apòsits Ag1+ + EDTA/BC van tenir un rendiment similar als apòsits amb sals d'Ag oxigenades, amb taxes de supervivència del 13% i el 14%, respectivament. L'apòsit Ag1+ també va reduir la viabilitat bacteriana en un 21%. Aquests biofilms es van observar mitjançant microscòpia electrònica de rastreig (SEM). Després del tractament amb l'apòsit de control i l'apòsit Ag1+, es va observar una capa de Pseudomonas aeruginosa que cobria la pell porcina (Figura 2F,H), mentre que després del tractament amb l'apòsit Ag1+, es van trobar poques cèl·lules bacterianes i poques cèl·lules bacterianes a sota. Les fibres de col·lagen es poden considerar com l'estructura tissular de la pell porcina (Figura 2G). Després del tractament amb l'apòsit Ag1+ + EDTA/BC, es van veure plaques bacterianes i plaques de fibres de col·lagen subjacents (Figura 2I).
Visualització del biofilm de Pseudomonas aeruginosa després del tractament amb apòsits de plata. (A–D) La viabilitat bacteriana en biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivats sobre pell porcina es va visualitzar mitjançant el colorant de viabilitat PrestoBlue 24 hores després del tractament amb apòsits de plata o apòsits de control no antimicrobians. Els bacteris vius són de color rosa, els bacteris no viables i la pell de porc són blaus. (E) Quantificació de biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivats sobre pell porcina (taca rosa) mitjançant microscòpia electrònica de rastreig Image Pro versió 10 (FI) i tractats amb un apòsit de plata o un apòsit de control no antimicrobian durant 24 hores. Barra d'escala SEM = 5 µm. (J–M) Els biofilms colonials van créixer sobre filtres i es van tenyir amb colorant reactiu PrestoBlue després de 24 h d'incubació amb apòsits de plata.
Per determinar si el contacte estret entre els apòsits i els biofilms afectava l'eficàcia dels apòsits, es van tractar biofilms colonials col·locats sobre una superfície plana amb els apòsits durant 24 hores i després es van tenyir amb colorants reactius. El biofilm sense tractament era de color rosa fosc (Figura 2J). A diferència dels biofilms tractats amb apòsits que contenien sals d'Ag oxigenades (Figura 2K), els biofilms tractats amb apòsits que contenien Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC van mostrar bandes de tinció rosa (Figura 2L,M). Aquesta coloració rosa indica la presència de bacteris viables i està associada amb la zona de sutura dins de l'apòsit. Aquestes zones cosides creen espais morts que permeten que els bacteris dins del biofilm sobrevisquin.
Per avaluar l'eficàcia dels apòsits de plata in vivo, es van tractar ferides excisades de gruix complet de ratolins infectats amb biofilms madurs de S. aureus i P. aeruginosa amb apòsits de control no antimicrobians o apòsits de plata. Després de 3 dies de tractament, l'anàlisi d'imatges macroscòpiques va mostrar mides de ferides més petites quan es van tractar amb apòsits de sal oxigenada en comparació amb apòsits de control no antimicrobians i altres apòsits de plata (Figura 3A-H). Per confirmar aquestes observacions, es van recollir ferides i es va quantificar l'àrea de la ferida i la reepitelització en seccions de teixit tenyides amb hematoxilina i eosina mitjançant el programari Image Pro versió 10 (Figura 3I-L).
L'efecte dels apòsits de plata sobre la superfície de la ferida i la reepitelització de ferides infectades amb biofilms. (A-H) Cèl·lules petites infectades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (A-D) i Staphylococcus aureus (E-H) després de tres dies de tractament amb un apòsit de control no antimicrobià, un apòsit de sal d'Ag oxigenada, un apòsit Ag1+ i un apòsit Ag1+. Imatges macroscòpiques representatives. Ferides de ratolins amb apòsit Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infecció representativa per Pseudomonas aeruginosa, seccions histològiques tenyides amb hematoxilina i eosina, utilitzades per quantificar l'àrea de la ferida i la regeneració epitelial. Quantificació de l'àrea de la ferida (M, O) i percentatge de reepitelització (N, P) de ferides infectades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (M, N) i Staphylococcus aureus (O, P) (per grup de tractament n = 12). Els gràfics mostren la mitjana +/- error estàndard. * significa p = < 0,05 ** significa p = < 0,01; Escala macroscòpica = 2,5 mm, escala histològica = 500 µm.
La quantificació de l'àrea de la ferida en ferides infectades amb biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) va mostrar que les ferides tractades amb oxals d'Ag tenien una mida mitjana de la ferida de 2,5 mm2, mentre que l'apòsit de control no antimicrobià tenia una mida mitjana de la ferida de 3,1 mm2, cosa que no és certa. va assolir significació estadística (Figura 3M). p = 0,423). Les ferides tractades amb Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC no van mostrar cap reducció de l'àrea de la ferida (3,1 mm2 i 3,6 mm2, respectivament). El tractament amb apòsit de sals d'Ag oxigenades va promoure la reepitelització en major mesura que l'apòsit de control no antimicrobià (34% i 15%, respectivament; p = 0,029) i Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC (10% i 11%) (Figura 3N). . , respectivament).
Es van observar tendències similars en la superfície de la ferida i la regeneració epitelial en ferides infectades amb biofilms de S. aureus (Figura 3O). Els apòsits que contenien sals de plata oxigenades van reduir la superfície de la ferida (2,0 mm2) en un 23% en comparació amb l'apòsit no antimicrobià de control (2,6 mm2), tot i que aquesta reducció no va ser significativa (p = 0,304) (Fig. 3O). A més, la superfície de la ferida en el grup de tractament amb Ag1+ es va reduir lleugerament (2,4 mm2), mentre que la ferida tractada amb apòsit Ag1+ + EDTA/BC no va reduir la superfície de la ferida (2,9 mm2). Les sals d'oxigen de l'Ag també van promoure la reepitelització de les ferides infectades amb biofilm de S. aureus (31%) en major mesura que les tractades amb apòsits de control no antimicrobians (12%, p = 0,003) (Figura 3P). L'apòsit Ag1+ (16%, p = 0,903) i l'apòsit Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) van mostrar nivells de regeneració epitelial similars al control.
Per visualitzar l'efecte dels apòsits de plata sobre la matriu del biofilm, es va realitzar tinció amb iodur de Toto 1 i Syto 60 (Fig. 4). El iodur de Toto 1 és un colorant impermeable a les cèl·lules que es pot utilitzar per visualitzar amb precisió els àcids nucleics extracel·lulars, que són abundants a l'EPS dels biofilms. El Syto 60 és un colorant permeable a les cèl·lules que s'utilitza com a contratinció16. Les observacions del iodur de Toto 1 i Syto 60 en ferides inoculades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) i Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) van mostrar que després de 3 dies de tractament amb apòsit, l'EPS al biofilm es va reduir significativament. Els apòsits Ag1+ sense components addicionals d'antibiofilm van reduir significativament l'ADN lliure de cèl·lules en ferides inoculades amb Pseudomonas aeruginosa, però van ser menys efectius en ferides inoculades amb Staphylococcus aureus.
Imatges in vivo de biofilm de ferides després de 3 dies de tractament amb apòsits de control o de plata. Imatges confocals de Pseudomonas aeruginosa (A-D) i Staphylococcus aureus (I-L) tenyides amb Toto 1 (verd) per visualitzar àcids nucleics extracel·lulars, un component dels polímers de biofilm extracel·lulars. Per tenyir àcids nucleics intracel·lulars, utilitzeu Syto 60 (vermell). àcids. P. Microscòpia electrònica de rastreig de ferides infectades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (E-H) i Staphylococcus aureus (M-P) després de 3 dies de tractament amb apòsits de control i de plata. Barra d'escala SEM = 5 µm. Barra d'escala d'imatge confocal = 50 µm.
La microscòpia electrònica de rastreig va mostrar que els ratolins inoculats amb colònies de biofilm de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) i Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) tenien significativament menys bacteris a les ferides després de 3 dies de tractament amb apòsits de plata.
Per avaluar l'efecte dels apòsits de plata sobre la inflamació de ferides en ratolins infectats amb biofilm, es van tenyir immunohistoquímicament seccions de ferides infectades amb biofilm tractades amb apòsits de control o de plata durant 3 dies utilitzant anticossos específics per a neutròfils i macròfags. Determinació quantitativa de neutròfils i macròfags internament. teixit de granulació. Figura 5). Tots els apòsits de plata van reduir el nombre de neutròfils i macròfags en ferides infectades amb Pseudomonas aeruginosa en comparació amb els apòsits de control no antimicrobians després de tres dies de tractament. Tanmateix, el tractament amb l'apòsit de sal de plata oxigenada va resultar en una major reducció de neutròfils (p = <0,0001) i macròfags (p = <0,0001) en comparació amb altres apòsits de plata provats (Figura 5I,J). Tot i que Ag1+ + EDTA/BC va tenir un efecte més gran sobre el biofilm de la ferida, va reduir els nivells de neutròfils i macròfags en menor mesura que l'apòsit Ag1+. També es van observar ferides moderades infectades amb biofilm de S. aureus després de vestir-les amb oxisols d'Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) i Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) en comparació amb el control. S'observen tendències similars per a la neutropènia. (Fig. 5K). Tanmateix, només l'apòsit amb sals d'Ag oxigenades va mostrar una reducció significativa del nombre de macròfags en el teixit de granulació en comparació amb el control en ferides infectades amb biofilms de S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
Els neutròfils i macròfags es van quantificar en ferides infectades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus després de 3 dies de tractament amb control no antimicrobià o apòsits de plata. Els neutròfils (AD) i els macròfags (EH) es van quantificar en seccions de teixit tenyides amb anticossos específics per a neutròfils o macròfags. Quantificació de neutròfils (I i K) i macròfags (J i L) en ferides infectades amb biofilms de Pseudomonas aeruginosa (I i J) i Staphylococcus aureus (K i L). N = 12 per grup. Els gràfics mostren la mitjana +/- error estàndard, valors de significació en comparació amb l'apòsit de control no antibacterià, * significa p = < 0,05, ** significa p = < 0,01; *** significa p = < 0,001; indica p = <0,0001).
A continuació, vam avaluar l'efecte dels apòsits de plata sobre la curació independent de la infecció. Les ferides excisionals no infectades es van tractar amb un apòsit de control no antimicrobià o un apòsit de plata durant 3 dies (Figura 6). Entre els apòsits de plata provats, només les ferides tractades amb l'apòsit de sal oxigenada van semblar més petites en imatges macroscòpiques que les ferides tractades amb el control (Figura 6A-D). La quantificació de l'àrea de la ferida mitjançant anàlisi histològica va mostrar que l'àrea mitjana de la ferida després del tractament amb l'apòsit d'oxisols d'Ag va ser de 2,35 mm2 en comparació amb els 2,96 mm2 de les ferides tractades amb el grup control, però aquesta diferència no va assolir significació estadística (p = 0,488) (Fig. 6I). En canvi, no es va observar cap reducció de l'àrea de la ferida després del tractament amb apòsits Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) o Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) en comparació amb el grup control. Es va observar una major regeneració epitelial amb l'apòsit d'oxisol d'Ag en comparació amb el grup control (30% vs. 22%, respectivament), tot i que això no va assolir significació (p = 0,067), això és força significatiu i confirma resultats anteriors. Un apòsit amb oxisols promou la reepitelització. -Epitelització de ferides no infectades17. En canvi, el tractament amb apòsits Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC no va tenir cap efecte o va mostrar una disminució de la reepitelització en comparació amb el control.
Efecte de l'apòsit de plata per a ferides sobre la cicatrització de ferides en ratolins no infectats amb resecció completa. (AD) Imatges macroscòpiques representatives de ferides després de tres dies de tractament amb un apòsit de control no antimicrobià i un apòsit de plata. (EH) Seccions representatives de ferides tenyides amb hematoxilina i eosina. La quantificació de l'àrea de la ferida (I) i el percentatge de reepitelització (J) es van calcular a partir de seccions histològiques al punt mig de la ferida mitjançant un programari d'anàlisi d'imatges (n = 11–12 per grup de tractament). Els gràfics mostren la mitjana +/- error estàndard. * mitjanes p = <0,05.
La plata té una llarga història d'ús com a teràpia antimicrobiana en la cicatrització de ferides, però les moltes formulacions i mètodes d'administració diferents poden resultar en diferències en l'eficàcia antimicrobiana 18. A més, les propietats antibiofilm de sistemes específics d'administració de plata no es coneixen completament. Tot i que la resposta immunitària de l'hoste és relativament eficaç contra els bacteris planctònics, generalment és menys eficaç contra els biofilms 19. Els bacteris planctònics són fagocits fàcilment pels macròfags, però dins dels biofilms, les cèl·lules agregades plantegen problemes addicionals en limitar la resposta de l'hoste fins al punt que les cèl·lules immunitàries poden patir apoptosi i alliberar factors proinflamatoris per millorar la resposta immunitària 20. S'ha observat que alguns leucòcits poden penetrar els biofilms 21 però no poden fagocitar bacteris un cop aquesta defensa es veu compromesa 22. S'hauria d'utilitzar un enfocament holístic per donar suport a la resposta immunitària de l'hoste contra la infecció del biofilm de la ferida. El desbridament de ferides pot interrompre físicament el biofilm i eliminar la major part de la càrrega bioactiva, però la resposta immunitària de l'hoste pot ser ineficaç contra el biofilm restant, especialment si la resposta immunitària de l'hoste es veu compromesa. Per tant, les teràpies antimicrobianes com els apòsits de plata poden donar suport a la resposta immunitària de l'hoste i eliminar les infeccions per biofilms. La composició, la concentració, la solubilitat i el substrat d'administració poden influir en l'eficàcia antimicrobiana de la plata. En els darrers anys, els avenços en la tecnologia de processament de la plata han fet que aquests apòsits siguin més eficaços9,23. A mesura que avança la tecnologia dels apòsits de plata, és important comprendre l'eficàcia d'aquests apòsits per controlar la infecció de la ferida i, el que és més important, l'impacte d'aquestes potents formes de plata en l'entorn de la ferida i la curació.
En aquest estudi, vam comparar l'efectivitat de dos apòsits de plata avançats amb apòsits de plata convencionals que produeixen ions Ag1+ contra biofilms utilitzant diferents models in vitro i in vivo. També vam avaluar l'efecte d'aquests apòsits sobre l'entorn de la ferida i la cicatrització independent de la infecció. Per minimitzar la influència de la matriu d'administració, tots els apòsits de plata provats estaven compostos de carboximetilcel·lulosa.
La nostra avaluació preliminar d'aquests apòsits de plata contra biofilms colonials de Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus mostra que, a diferència dels apòsits tradicionals d'Ag1+, dos apòsits de plata avançats, Ag1+ + EDTA/BC i sals d'Ag oxigenades, són eficaços a 5. Eliminen eficaçment els bacteris del biofilm en pocs dies. A més, aquests apòsits eviten la reformació del biofilm després de l'exposició repetida a bacteris planctònics. L'apòsit Ag1+ contenia clorur de plata, el mateix compost de plata i matriu base que Ag1+ + EDTA/BC, i va tenir un efecte limitat sobre la viabilitat bacteriana dins del biofilm durant el mateix període. L'observació que un apòsit Ag1+ + EDTA/BC era més eficaç contra el biofilm que un apòsit Ag1+ que consistia en la mateixa matriu i un compost de plata recolza la idea que es necessiten ingredients addicionals per augmentar l'eficàcia del clorur de plata contra el biofilm, tal com s'ha informat en altres llocs15. Aquests resultats donen suport a la idea que el BC i l'EDTA tenen un paper addicional que contribueix a l'eficàcia general dels apòsits i que l'absència d'aquest component en els apòsits Ag1+ pot haver contribuït a la impossibilitat de demostrar l'eficàcia in vitro. Vam trobar que els apòsits amb sals d'Ag oxigenades que produeixen ions Ag2+ i Ag3+ van mostrar una eficàcia antibacteriana més forta que l'Ag1+ i a nivells similars a Ag1+ + EDTA/BC. Tanmateix, a causa de l'alt potencial redox, no està clar quant de temps els ions Ag3+ romanen actius i eficaços contra els biofilms de les ferides i, per tant, mereixen més estudis. A més, hi ha molts apòsits diferents que generen ions Ag1+ que no s'han provat en aquest estudi. Aquests apòsits estan compostos de diferents compostos de plata, concentracions i matrius base, que poden influir en l'administració d'ions Ag1+ i la seva eficàcia contra els biofilms. També val la pena assenyalar que hi ha molts models in vitro i in vivo diferents que s'utilitzen per avaluar l'eficàcia dels apòsits per a ferides contra els biofilms. El tipus de model utilitzat, així com el contingut de sal i proteïnes dels medis utilitzats en aquests models, influiran en l'eficàcia de l'apòsit. En el nostre model in vivo, vam permetre que el biofilm madurés in vitro i després el vam transferir a la superfície dèrmica de la ferida. La resposta immunitària del ratolí hoste és relativament eficaç contra els bacteris planctònics aplicats a la ferida, formant així un biofilm a mesura que la ferida es cura. L'addició de biofilm madur a una ferida limita l'eficàcia de la resposta immunitària de l'hoste a la formació de biofilm, ja que permet que el biofilm madur s'estableixi dins de la ferida abans que pugui començar la curació. Per tant, el nostre model ens permet avaluar l'eficàcia dels apòsits antimicrobians en biofilms madurs abans que les ferides comencin a curar-se.
També vam descobrir que l'ajust de l'apòsit influïa en l'eficàcia dels apòsits de plata en biofilms cultivats in vitro i pell porcina. El contacte proper amb la ferida es considera crític per a l'eficàcia antimicrobiana de l'apòsit24,25. Els apòsits que contenien sals d'Ag oxigenades estaven en contacte proper amb biofilms madurs, cosa que va provocar una reducció significativa del nombre de bacteris viables dins del biofilm després de 24 hores. En canvi, quan es van tractar amb apòsits Ag1+ i Ag1+ + EDTA/BC, hi havia un nombre significatiu de bacteris viables. Aquests apòsits contenen sutures al llarg de tota la longitud de l'apòsit, cosa que crea espais morts que impedeixen el contacte proper amb el biofilm. En els nostres estudis in vitro, aquestes zones sense contacte van impedir la mort de bacteris viables dins del biofilm. Vam avaluar la viabilitat bacteriana només després de 24 hores de tractament; amb el temps, a mesura que l'apòsit es satura més, pot haver-hi menys espai mort, cosa que redueix l'àrea per a aquests bacteris viables. Tanmateix, això destaca la importància de la composició de l'apòsit, no només del tipus de plata de l'apòsit.
Si bé els estudis in vitro són útils per comparar l'eficàcia de diferents tecnologies de plata, també és important entendre els efectes d'aquests apòsits sobre els biofilms in vivo, on el teixit hoste i les respostes immunitàries contribueixen a l'eficàcia dels apòsits contra els biofilms. L'efecte d'aquests apòsits sobre els biofilms de ferides es va observar mitjançant microscòpia electrònica de rastreig i tinció EPS del biofilm utilitzant colorants d'ADN intracel·lulars i extracel·lulars. Vam trobar que després de 3 dies de tractament, tots els apòsits eren eficaços per reduir l'ADN lliure de cèl·lules en ferides infectades amb biofilm, però l'apòsit Ag1+ va ser menys eficaç en ferides infectades per Staphylococcus aureus. La microscòpia electrònica de rastreig també va mostrar que hi havia significativament menys bacteris presents a les ferides tractades amb els apòsits de plata, tot i que això va ser més pronunciat amb l'apòsit de sal d'Ag oxigenada i l'apòsit Ag1+ + EDTA/BC en comparació amb l'apòsit Ag1+. These data show that the silver dressings tested had varying degrees of impact on biofilm structure, but none of the silver dressings were able to eradicate the biofilm, supporting the need for a holistic approach to the treatment of wound biofilm infections; use of silver armbands. Treatment is preceded by physical debridement to remove most of the biofilm.
Les ferides cròniques sovint es troben en un estat d'inflamació greu, amb un excés de cèl·lules inflamatòries que romanen al teixit de la ferida durant un període de temps prolongat, causant danys als teixits i esgotant l'oxigen necessari per a un metabolisme i una funció cel·lular eficients a la ferida26. Els biofilms agreugen aquest entorn hostil de la ferida afectant negativament la curació de diverses maneres, com ara la inhibició de la proliferació i la migració cel·lular i l'activació de citocines proinflamatòries27. A mesura que els apòsits de plata es tornen més eficaços, és important entendre l'impacte que tenen sobre l'entorn de la ferida i la curació.
Curiosament, tot i que tots els apòsits de plata van afectar la composició del biofilm, només els apòsits de sals de plata oxigenades van augmentar la reepitelització d'aquestes ferides infectades. Aquestes dades donen suport a les nostres troballes anteriors17 i a les de Kalan et al. (2017)28, que van demostrar bons perfils de seguretat i toxicitat de les sals de plata oxigenades, ja que concentracions més baixes de plata van ser efectives contra els biofilms.
El nostre estudi actual destaca les diferències en la tecnologia de la plata entre els apòsits de plata antimicrobians i l'impacte d'aquesta tecnologia en l'entorn de la ferida i la curació independent de la infecció. Tanmateix, aquests resultats difereixen d'estudis anteriors que mostren que l'apòsit Ag1+ + EDTA/BC millorava els paràmetres de curació de les orelles de conill lesionades in vivo. Tanmateix, això pot ser degut a diferències en els models animals, els temps de mesura i els mètodes d'aplicació bacteriana29. En aquest cas, es van prendre mesures de la ferida 12 dies després de la lesió per permetre que els ingredients actius de l'apòsit actuessin sobre el biofilm durant un període de temps més llarg. Això està recolzat per un estudi que va demostrar que les úlceres de les cames clínicament infectades tractades amb Ag1+ + EDTA/BC inicialment van augmentar de mida després d'una setmana de tractament, i després durant les següents 3 setmanes de tractament amb Ag1+ + EDTA/BC i dins de les 4 setmanes d'ús de fàrmacs no antimicrobians. Apòsits CMC per reduir la mida de les úlceres30.
Prèviament s'ha demostrat que certes formes i concentracions de plata són citotòxiques in vitro 11, però aquests resultats in vitro no sempre es tradueixen en efectes adversos in vivo. A més, els avenços en la tecnologia de la plata i una millor comprensió dels compostos i les concentracions de plata en els apòsits han conduït al desenvolupament de molts apòsits de plata segurs i eficaços. Tanmateix, a mesura que avança la tecnologia dels apòsits de plata, és important entendre l'impacte d'aquests apòsits en l'entorn de la ferida 31,32,33. Anteriorment es va informar que l'augment de la taxa de reepitelització correspon a una major proporció de macròfags M2 antiinflamatoris en comparació amb el fenotip M1 proinflamatori. Això es va observar en un model de ratolí previ on es van comparar apòsits per a ferides d'hidrogel de plata amb sulfadiazina de plata i hidrogels no antimicrobians 34.
Les ferides cròniques poden presentar una inflamació excessiva i s'ha observat que la presència d'un excés de neutròfils pot ser perjudicial per a la cicatrització de les ferides35. En un estudi en ratolins amb depleció de neutròfils, la presència de neutròfils va retardar la reepitelització. La presència d'un excés de neutròfils condueix a alts nivells de proteases i espècies reactives d'oxigen, com el superòxid i el peròxid d'hidrogen, que s'associen amb ferides cròniques i de curació lenta37,38. De la mateixa manera, un augment del nombre de macròfags, si no es controla, pot conduir a un retard en la cicatrització de les ferides39. Aquest augment és particularment important si els macròfags no poden fer la transició d'un fenotip proinflamatori a un fenotip procuració, cosa que fa que les ferides no surtin de la fase inflamatòria de curació40. Vam observar una disminució de neutròfils i macròfags en ferides infectades amb biofilm després de 3 dies de tractament amb apòsits de plata, però la disminució va ser més pronunciada amb els apòsits de sal oxigenada. Aquesta disminució pot ser un resultat directe de la resposta immunitària a la plata, una resposta a la disminució de la càrrega bioactiva o que la ferida es troba en una fase posterior de curació i, per tant, es redueixen les cèl·lules immunitàries de la ferida. La reducció del nombre de cèl·lules inflamatòries de la ferida pot mantenir un entorn propici per a la curació de les ferides. El mecanisme d'acció de com les oxilsals d'Ag promouen la curació independent de la infecció no està clar, però la capacitat de les oxilsals d'Ag per produir oxigen i destruir els nivells nocius de peròxid d'hidrogen, un mediador de la inflamació, pot explicar-ho i requereix més estudis17.
Les ferides infectades cròniques que no es cicatritzen representen un problema tant per als metges com per als pacients. Tot i que molts apòsits afirmen tenir eficàcia antimicrobiana, la recerca poques vegades se centra en altres factors clau que influeixen en el microambient de la ferida. Aquest estudi demostra que les diferents tecnologies de plata tenen una eficàcia antimicrobiana diferent i, el que és més important, efectes diferents sobre l'entorn de la ferida i la cicatrització, independentment de la infecció. Tot i que aquests estudis in vitro i in vivo mostren l'eficàcia d'aquests apòsits en el tractament d'infeccions de ferides i la promoció de la cicatrització, calen assajos controlats aleatoris per avaluar l'eficàcia d'aquests apòsits a la clínica.
Els conjunts de dades utilitzats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a través de l'autor corresponent si es sol·liciten de manera raonable.
Data de publicació: 15 de juliol de 2024